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目的尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide,NAD~+）不仅是线粒体有氧呼吸中的电子传递体，而且是第三类组蛋白/非组蛋白去乙酰化酶Sirt1必需的反应底物。然而，缺血再灌注损伤能消耗心肌细胞中的NAD~+。本研究探讨外源性加入NAD~+对缺氧复氧条件下H9c2心肌细胞生存率和细胞凋亡率的影响，以及该作用与Sirt1的关系，以分析NAD~+在缺氧复氧条件下的H9c2心肌细胞中的可能作用机制。方法第一部分：探讨不同作用时间点和不同处理浓度的外源性NAD~+对缺氧复氧条件下H9c2细胞生存率的影响。用含10%胎牛血清的DMEM/F-12培养液培养H9c2心肌细胞48小时后，在无糖无血清的“缺血缓冲液”中1%氧浓度下培养4小时随即在完全培养液中正常氧浓度下培养4小时以建立缺氧复氧模型。NAD~+（500μmol/L）在缺氧前2小时、缺氧开始时、缺氧开始后2小时、复氧开始时和复氧开始后2小时分别加入不同培养孔中，采用Cck-8法检测心肌细胞生存率。不同作用浓度（0、50、100、500、1000和5000μmol/L）的NAD~+在复氧开始时处理H9c2心肌细胞，采用Cck-8法检测心肌细胞生存率。第二部分：探讨外源性NAD~+对缺氧复氧条件下H9c2心肌细胞凋亡率的影响，以及其与Sirt1-p53通路的关系。采用含10%胎牛血清的DMEM/F-12培养液培养H9c2心肌细胞48小时后，将细胞随机分为6组：对照组（CON组）、缺氧复氧组（HR组）、单纯NAD~+处理组（NAD组）、NAD~+处理+缺氧复氧组（NADHR组）、Sirt1抑制剂+NAD~+处理+缺氧复氧组（ENHR组）和Sirt1抑制剂+缺氧复氧组（EHR组）。CON组：心肌细胞在完全条件下培养8小时。HR组：心肌细胞在“缺血缓冲液”中1%氧浓度下培养4小时（缺氧）随即在完全培养液中正常氧浓度下培养4小时（复氧）。NAD组：心肌细胞在完全条件下培养8小时，并且NAD~+在细胞培养4小时后加入培养液中。NAD~+HR组：心肌细胞缺氧4小时复氧4小时，并且NAD~+（500μmol/L）在复氧开始时加入细胞培养液中。ENHR组：心肌细胞缺氧4小时复氧4小时，并且NAD~+（500μmol/L）和Sirt1活性抑制剂EX527（1μmol/L）在复氧开始时加入细胞培养液中。EHR组：心肌细胞缺氧4小时复氧4小时，并且Sirt1活性抑制剂EX527（1μmol/L）在复氧开始时加入细胞培养液中。实验完成后，采用TUNEL法检测心肌细胞凋亡率，Western Blot法检测心肌细胞内Sirt1和BAX表达量以及细胞核内p53和ac-p53（lys373&382）的表达量，细胞核内Sirt1活性检测试剂盒检测Sirt1的活性。结果第一部分：外源性NAD~+在不同作用时间点和不同作用浓度时对缺氧复氧条件下H9c2心肌细胞生存率的影响不同。当NAD~+（500μmol/L）在缺氧开始前2小时加入细胞培养液中时，缺氧复氧条件下的H9c2心肌细胞生存率有一定程度但不显著的升高；当NAD~+在其余时间点加入细胞培养液时，缺氧复氧条件下的H9c2心肌细胞生存率显著升高。当NAD~+（500μmol/L）在复氧开始时立即加入细胞培养液中导致的缺氧复氧条件下的H9c2心肌细胞生存率升高程度最大。当NAD~+的作用浓度为50μmol/L时缺氧复氧条件下的H9c2心肌细胞生存率有一定程度但不显著的升高；其它的NAD~+作用浓度均使得缺氧复氧条件下的H9c2心肌细胞生存率显著升高。当NAD~+的作用浓度为500-1000μmol/L时缺氧复氧条件下的H9c2心肌细胞生存率升高程度最大。第二部分：各组细胞凋亡率和促凋亡蛋白BAX表达量比较：与CON组比较，HR组心肌细胞凋亡率显著升高，促凋亡蛋白BAX表达量显著升高；与HR组比较，NADHR组心肌细胞凋亡率显著降低，BAX蛋白表达量显著降低。与NADHR组比较，ENHR组细胞凋亡率再次显著升高，BAX蛋白表达量再次显著升高。各组Sirt1含量和活性比较：与CON组比较，HR组H9c2心肌细胞核内Sirt1活性显著降低；与HR组比较，NADHR组H9c2心肌细胞核内Sirt1活性显著升高。与NADHR组比较，ENHR组H9c2心肌细胞核内Sirt1活性显著降低。各组心肌细胞内Sirt1表达量无显著差异。各组ac-p53（lys373&382）/p53表达比例比较：与CON组比较， HR组H9c2心肌细胞核内ac-p53（lys373&382）/p53表达比例显著升高；与HR组比较， NADHR组H9c2心肌细胞核内ac-p53（lys373&382）/p53表达比例显著降低。与NADHR组比较，ENHR组ac-p53（lys373&382）/p53表达比例显著升高。结论外源性加入NAD~+能降低缺氧复氧条件下的H9c2心肌细胞死亡，并且该作用具有时间依赖性和药物浓度依赖性。当NAD~+在复氧开始时加入细胞培养液，以及NAD~+的作用浓度为500-1000μmol/L时，其心肌保护作用最强。外源性加入NAD~+能降低缺氧复氧导致的H9c2心肌细胞凋亡率，该作用可能与NAD~+使心肌细胞核内Sirt1活性提高，进而通过降低p53在第373和382赖氨酸位点的乙酰化水平而降低p53活性有关。