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目前全世界约有3.5亿慢性HBV(hepatits B virus，HBV)感染者，HBV持续感染是导致慢性肝炎后肝硬化、肝细胞性肝癌等疾病的重要原因，严重威胁着人类健康。目前使用的药物如干扰素、核苷类似物等在治疗的有效性、治疗后复发率等方面尚不理想。RNA干扰(RNA interference，RNAi)是一项新兴的基因沉默技术，是指长21-23bp的双链小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)诱导序列高度同源的mRNA降解从而导致转录后基因沉默的现象。研究表明，长度在21-23bp的siRNA并不激活哺乳动物细胞的非特异性反应，使siRNA用于抗HBV治疗成为可能。由于RNAi的作用对象是病毒的mRNA，可针对HBV基因组的不同保守区域设计一个或多个siRNA，减少病毒通过变异逃避攻击的可能性，从而弥补核苷类似物类药物的不足。目前的研究已分别在细胞和动物实验中证实RNAi的抗HBV的作用，使RNAi有望成为抗乙肝病毒治疗的新选择。而将RNAi用于抗HBV的临床治疗，一个理想的输送siRNA的载体是其中的关键环节。近些年分子生物学迅速发展，人们对病毒基因组的结构、功能以及感染机制的研究不断深入，病毒载体的构建技术不断得到改进并在基因治疗中显示了良好的应用前景。腺病毒是目前基因治疗中应用最广的病毒载体之一，作为非整合类病毒，具有感染的宿主范围广，外源基因表达水平高，在受染细胞内不发生整合，没有致癌和致突变的危险等优点，在应用RNAi治疗疾病的研究中倍受关注。本实验通过构建同时表达GFP和shRNA的重组腺病毒载体，体外感染具有HBV持续复制和病毒蛋白表达能力的HepG2.2.15细胞，观察其对HBV复制的抑制效果，验证腺病毒载体输送的shRNA抑制HBV复制的有效性并为进一步的动物实验打下基础，研究和评价该重组腺病毒对HBV持续感染的可能治疗作用和应用前景，旨在发现一种更具备临床治疗可用性的载体。论文腺病毒载体介导的RNA干扰体外抑制HBV复制的研究1、重组穿梭质粒pShuttle+GFP+shDNA的构建利用BglⅡ和BamHⅠ双酶切后重新连接获得不含HindⅢ酶切位点的质粒pEGFP-C切，设计两端含HindⅢ和BglⅡ酶切位点的引物扩增包括CMV启动子的绿荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)表达框。PCR产物经双酶切后与载体质粒pShuttle连接，通过特异性PCR反应、转染HEK293细胞等方法筛选和鉴定有效克隆，获得重组质粒pShuttle+GFP。再设计一引物从质粒pAV6扩增含U6启动子的针对HBV S基因579-597位的小发夹RNA(small hairpin RNA，shRNA)表达框，经酶切纯化后克隆至pShuttle+GFP载体，特异性PCR反应、测序鉴定获得重组质粒pShuttle+GFP+shDNA。2、重组腺病毒载体的构建与鉴定将质粒pShuttle+GFP+shDNA用PmeⅠ酶切纯化后，取线性化质粒50-100ng，在200Ω，2.5KV，25μF条件下电转化至BJ5183感受态细菌，菌液在卡那抗性的平板培养过夜，次日挑取中、小克隆摇菌，抽提质粒，用PacⅠ酶酶切鉴定阳性克隆后将质粒转化DH5a感受态细菌，以获得产量更多的重组腺病毒质粒。3、重组腺病毒的包装、扩增与病毒滴度测定取5μg用PmeⅠ酶切后的线性质粒用于转染HEK293细胞，待细胞基本全部出现病变效应后收集细胞。收集到的细胞上清液和细胞裂解液再次感染HEK293细胞，待3-5天细胞全部出现病变效应后收集到更多的病毒液。以不同比例稀释细胞裂解液，分别感染HEK293细胞，30小时后流式细胞仪检测表达GFP的细胞数量，估计病毒滴度。4、不同MOI重组腺病毒对RNAi效果的影响在24孔培养板中接种HepG2.2.15细胞，培养24-48h，待细胞达40-50％融合率后，分别按MOI为80，160的重组腺病毒量感染细胞。第2，5，8，11天收集细胞上清进行HBsAg和HBeAg的放射免疫法检测和HBV DNA的荧光定量PCR的检测；第2天收集细胞进行流式细胞仪GFP表达细胞数的检测；第4天收集细胞进行HBV RNA的检测。5、HepG2.2.15细胞上清HBsAg和HBeAg的检测MOI为80，160的重组腺病毒量感染细胞后，上清检测显示HBsAg和HBeAg的分泌作用组均较相应对照组下降，这种下降作用在第8天达到高峰，HBsAg和HBeAg的抑制率分别为64％(MOI=80)，92％(MOI=160)和39％(MOI=80)，61％(MOI=160)。抑制作用一直持续到11天。上述结果表明AD-GFP-ShDNA抑制HepG2.2.15细胞分泌HBsAg和HBeAg。6、HepG2.2.15细胞中HBV RNA的检测感染后第4天，收集细胞抽提RNA，逆转录后以cDNA为模板，设计HBc基因区引物扩增目的基因，同时以β-actin基因作为内参基因进行PCR扩增，各取等量PCR产物电泳，结果显示作用组目的基因条带弱于对照组，显示HBVRNA被腺病毒输送的shRNA抑制。7、HepG2.2.15细胞上清HBV DNA的检测收集病毒感染2d，5d，8d，11d的细胞培养上清，提取HBV DNA，实时荧光定量PCR检测HBV DNA拷贝数。对照组AD-GFP组与作用组AD-GFP-shDNA组在感染后HBV DNA拷贝数均逐渐上升至11天达到高峰，但作用组AD-GFP-shDNA组在感染5天后HBV DNA载量的上升趋势明显弱于对照AD-GFP组，两者的差距在第11天达到最大。结果显示腺病毒载体输送的shRNA降低了HepG2.2.15细胞上清HBV DNA的浓度。8、结论：(1)成功构建了表达GFP和shRNA的复制缺陷型重组腺病毒Ad-GFP-shDNA。(2)该重组腺病毒可有效抑制HepG2.2.15细胞的HBV复制和蛋白表达。