论文部分内容阅读
目的膀胱癌是泌尿系统中最常见的肿瘤之一。在我国泌尿、男生殖系统肿瘤中,膀胱癌的发病率和病死率均占首位,所以膀胱癌始终是恶性肿瘤研究中的一个焦点。90%的膀胱肿瘤为移行细胞癌,近年来畅继武教授发现,膀胱移行细胞癌从生物学行为到病理形态可分成低恶性与高恶性膀胱移行细胞癌两种类型,常被称之为两类癌。两类癌概念的提出为人们从分子水平与基因水平对膀胱移行细胞癌进行分类与研究提供了新的视角,并为阐明其发病机制与指导治疗,以及推测预后提供了更具科学性的依据,具有重要的理论与现实意义。因此,本研究以两类癌为基础,运用蛋白质组学的研究策略对高恶性膀胱移行细胞癌和癌旁相应正常膀胱移行上皮进行了蛋白质表达谱的差异分析,并对筛选出的有潜在应用价值的差异蛋白进行再验证,试图发现与高恶性膀胱移行细胞癌发生进展相关的生物学标记物,并初步探讨其临床应用价值。方法1.收集高恶性膀胱移行细胞癌的膀胱全切标本,利用手工显微切割联合双向电泳、考马斯亮蓝染色,对高恶性膀胱移行细胞癌和癌旁相应正常膀胱移行上皮进行蛋白分离。采用凝胶图像分析软件并结合人工比对从两块胶匹配点中筛选出差异3倍及其以上的蛋白点,为后续质谱分析奠定基础。2.对于双向电泳分离出的,凝胶图像选定的差异蛋白斑点,通过基质辅助激光解吸/电离串联飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF-MS)技术进行蛋白质鉴定分析,对得到的肽质量指纹图谱和部分肽段氨基酸序列结合其等电点、分子量、物种来源、修饰情况等参数在Mascot蛋白数据库中检索,进行蛋白的鉴定。3.采用半定量RT-PCR技术和免疫组织化学技术对从第一和第二部分筛选鉴定出的差异蛋白mortalin进行mRNA水平和蛋白水平的表达验证。扩展的免疫组织化学检测mortalin在34例初发膀胱移行细胞癌中的表达情况,联系临床病理资料,初步探讨其临床的应用价值。结果1.成功得到了高恶性膀胱移行细胞癌和相应正常膀胱移行上皮的双向电泳图谱,通过凝胶分析软件分析了差异蛋白斑点,并从中筛选出了20个差异较大的蛋白点(差异3倍及以上)。2.利用MALDI-TOF/TOF-MS仪结合数据库检索对上述20个蛋白点进行鉴定。最后得到符合条件的差异表达蛋白11个,其中mortalin、角蛋白7(CK-7)、微管蛋白β4(Tubulin beta-Ⅲ)、抑制素(Prohibitin)、膜联蛋白Ⅳ(Annexin A4)、蛋白质二硫键异构酶A6前体蛋白(PDIA6)、HSP60在肿瘤组织中表达上调;角蛋白8(CK-8)、14-3-3ε蛋白、膜联蛋白V(Annexin A5)、结蛋白(Desmin)在肿瘤组织中表达下调。运用蛋白数据库和文献数据库的大量信息,对上述11种蛋白进行相关信息的汇总分析,其中5个蛋白在文献中曾经报道过,其表达失调与膀胱癌的发生发展可能相关;其余6个蛋白目前尚未见到与膀胱癌的相关报道,包括:mortalin、14-3-3ε蛋白、蛋白质二硫键异构酶A6前体蛋白、膜联蛋白Ⅳ、结蛋白、微管蛋白β4。3.半定量RT-PCR和免疫组织化学结果显示mortalin在高恶性膀胱移行细胞癌中mRNA和蛋白表达水平均高于正常膀胱移行上皮(P<0.01),与2-DE变化趋势一致。同时免疫组化证实mortalin主要定位在肿瘤细胞和移行上皮细胞的胞浆中。扩展的免疫组化研究表明:在膀胱移行细胞癌中mortalin的高表达与肿瘤的病理分级(R=0.601,P<0.01)和TNM分期(R=0.021,P<0.05)相关,mortalin的表达与其他临床病理特征,如肿瘤大小、部位、数目等未见明显相关。结论1.联合应用手工显微切割与蛋白组学技术,成功建立了高恶性膀胱移行细胞癌与相应正常膀胱移行上皮差异蛋白组学的研究方法。2.高恶性膀胱移行细胞癌的蛋白表达谱与相应正常的膀胱移行上皮组织相比有明显差异,经质谱鉴定了11个差异表达蛋白,表明膀胱移行细胞癌的发生是一个多基因多途径参与的复杂过程。3.Mortalin蛋白在高恶性膀胱移行细胞癌中的表达明显上调,结合扩展的免疫组化检测与临床病理资料相关性研究的结果表明:mortalin可能成为一种潜在的、有应用价值的预测膀胱移行细胞癌恶性程度及侵袭能力的肿瘤标记物。