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脑卒中是我国发病率高、危害大的心脑血管疾病,高血压是脑卒中一个重要的危险因素。脑卒中一个关键的病理变化为脑血管重构。血管平滑肌细胞的增殖、凋亡的失衡被认为是脑血管重构的重要因素。细胞增殖、凋亡等一些基本的生理过程中都伴随细胞容积变化。在细胞增殖的早期,由于大量氨基酸、核酸的合成,细胞发生渗透性容积肿胀。研究发现,在细胞分裂之前,细胞从细胞周期G0进入G1、S、G2过程中,伴随着细胞容积的增加。而细胞皱缩、核固缩、DNA断裂、细胞膜磷脂酰丝氨酸残基外翻是细胞凋亡过程中几个标志性改变,凋亡性容积减低(apoptotic volume decrease,AVD)导致的细胞皱缩早于或者伴随着其它几个改变。 维持细胞容积的稳态对于细胞正常的生理功能十分重要。细胞对容积的调节是通过细胞膜上离子通道和离子交换体来实现的。Cl-是细胞内、外液最主要的阴离子,容积调节性Cl-通道(volume regulated chloride channels,VRCC)在调节细胞容积,维持细胞内环境稳态中发挥重要作用。同时,研究发现容积调节性Cl-通道广泛参与了细胞增殖、凋亡、迁移等多种生理过程,并可能在高血压,动脉粥样硬化,肿瘤等多种病理过程扮演重要角色。 CLC-3,电压依赖性阴离子通道家族成员之一,被提出编码了豚鼠NIH/3T3心肌细胞容积调节性氯通道。我们实验室在血管平滑肌细胞上,运用膜片钳、单细胞实时动态离子影像技术,通过过表达和干扰CLC-3蛋白,从低渗刺激下氯离子跨膜电流和细胞内氯离子浓度变化两个角度,系统研究了CLC-3与VRCC的关系,证实CLC-3是血管平滑肌细胞VRCC的分子基础。 研究发现CLC-3广泛参与了细胞增殖、凋亡、迁移、炎症反应等多种病理生理过程。我们实验室研究证实,CLC-3在高血压脑血管重构中有重要作用。我们前期系列研究证实CLC-3可以促进脑基底动脉血管平滑肌细胞(BASMCs)的增殖,保护BASMCs的凋亡,从而参与高血压脑血管的重构。辛伐他汀通过抑制CLC-3从而改善高血压脑血管重构。CLC-3有望成为干预高血压脑血管重构的新靶点,但可作为靶点的CLC-3本身的调控机制研究资料十分匮乏,目前尚未见转录因子或miRNA调控CLC-3的有关报道。miRNA是生物内源性的小分子单链RNA,长18~25nt,可以与其靶基因mRNA分子的3’端非翻译区(3’-untranslated region,3’-UTR)互补匹配导致该mRNA分子降解或翻译抑制,从而调控靶基因的表达。 本课题旨在研究靶向调控CLC-3氯通道的miRNA,以及这些miRNA对脑血管平滑肌细胞增殖的影响。实验分为三个部分:第一部分,靶向调控CLC-3蛋白的miRNA鉴定;第二部分,靶向调控CLC-3的miRNA对血管平滑肌细胞的容积调节性氯通道功能的影响;第三部分,靶向调控CLC-3的miRNA对血管平滑肌细胞增殖的影响。 第一部分靶向调控CLC-3的miRNA鉴定 本部分首先联合运用TargentScan,miRGen,RNA22等miRNA靶基因预测有关软件对clc-3基因序列进行系统的生物信息学分析,找出可能调控CLC-3的miRNA:miR206,miR1,miR613:然后构建包含clc-33’-UTR中miRNA结合序列的荧光报告基因载体及缺失miRNA结合序列荧光报告基因载体突变体,人工合成这些miRNA mimics,转染A10细胞,观察miRNA mimics对荧光素酶活性的影响和CLC-3蛋白表达的影响,筛选出靶向调控CLC-3的miRNA:miR206:最后构建过表达miR206的慢病毒载体,在原代分离培养的大鼠脑基底动脉平滑肌细胞上,通过miR206的慢病毒感染(上调)和miR206 inhibitor转染(下调),观察其对荧光素酶活性的影响和CLC-3蛋白表达的影响。结果如下: 1.生物信息学提示3个miRNA可能参与CLC-3的靶向调控,分别为:miR206,miR1,miR613。 经分析,miR206,miR1,miR613的种子序列与clc-33’-UTR中有8个碱基的完全互补结合,可能参与CLC-3的靶向调控。 2.miR206 mimics可以抑制A10细胞clc-33’-UTR荧光报告基因载体荧光素酶活性 将包含与miR206,miR1,miR613种子序列互补的结合序列的clc-33-UTR克隆到pMIR-REPORTTM荧光素酶报告基因载体,转染A10细胞以检测miR206mimics,miR1 mimics,miR613 mimics对clc-33’-UTR荧光报告基因载体荧光素酶活性的影响。结果发现,只有miR206 mimics可以显著地抑制clc-33’-UTR荧光报告基因载体荧光素酶活性。 3.与miR206种子序列互补的结合序列的缺失突变可以消除miR206 mimics对clc-33’-UTR荧光报告基因载体荧光素酶活性的抑制作用。 缺失突变实验使clc.33’-UTR荧光报告基因载体中与miR206,miR1,miR613的种子序列完全互补结合的8个碱基去除,转染A10细胞以检测miR206 mimics。miR1 mimics,miR613 mimics对clc.33’-UTR荧光报告基因载体突变体的活性影响,结果表明此缺失突变可以消除miR206 mimics对clc-33’-UTR荧光报告基因载体荧光素酶活性的抑制作用。 4.miR206 mimics可以抑制A10细胞CLC-3蛋白表达 将miR206 mimics,miR1 mimics,miR613 mimics转染A10细胞,48h后裂解细胞收集蛋白作western blot实验检测CLC-3蛋白表达。结果发现,只有miR206 mimics可以显著抑制A10细胞CLC-3蛋白表达。 5.过表达miR206的慢病毒感染可以抑制基底动脉平滑肌细胞的clc-33’-UTR荧光报告基因载体荧光素酶活性,而miR206 inhitors转染可以增强基底动脉平滑肌细胞的clc-33’-UTR荧光报告基因载体荧光素酶活性 将大鼠miR206的基因序列克隆到pBABE慢病毒载体,构建pBABEmiR206慢病毒,感染原代分离培养的大鼠基底动脉平滑肌细胞,并作荧光素酶活性检测实验,发现pBABE miR206慢病毒感染可以抑制基底动脉平滑肌细胞的clc-33’-UTR荧光报告基因载体荧光素酶活性;而miR206 inhitors转染可以增强基底动脉平滑肌细胞的clc-33’-UTR荧光报告基因载体荧光素酶活性。 6.与miR206种子序列互补的结合序列的缺失突变可以消除pBABE miR206慢病毒和miR206 inhitors对基底动脉平滑肌细胞的clc-33’-UTR荧光报告基因载体荧光素酶活性的影响。 缺失突变可以消除pBABE miR206慢病毒对基底动脉平滑肌细胞clc-33’-UTR荧光报告基因载体荧光素酶活性的抑制作用;缺失突变可以消除miR206inhibitors对基底动脉平滑肌细胞clc-33’-UTR荧光报告基因载体荧光素酶活性的增强作用。 7.miR206的慢病毒感染可以抑制基底动脉平滑肌细胞的CLC-3蛋白表达,而miR206 inhitors转染可以增强基底动脉平滑肌细胞的CLC-3蛋白表达 小结 1.应用生物信息学分析发现可能靶向调控CLC-3的3个miRNA,分别是miR206,miR1,miR613。 2.在A10血管平滑肌细胞株上,人工合成miR206,miR1,miR613的mimics, 通过clc-33’-UTR荧光素酶实验和CLC-3蛋白检测实验,筛选出靶向调控CLC-3的miRNA为miR206。 3.在原代分离培养的大鼠基底动脉平滑肌细胞上,通过pBABE miR206慢病毒感染和miR206 inhibitors转染,从clc-33’-UTR荧光素酶实验和CLC-3蛋白检测实验两个方面,证实miR206对CLC-3的靶向调控。 第二部分 miR206对容积调节性氯通道功能的影响 我们实验室前面已经证实CLC-3是血管平滑肌细胞容积调节性氯通道的分子基础。第一部分我们已经发现miR206可以靶向调控CLC-3的表达,本部分实验采用pBABE miR206慢病毒感染原代分离培养的大鼠基底动脉平滑肌细胞,运用膜片钳和单细胞离子实时影像技术,观察miR206对容积调节性氯电流和容积调节性氯运动的影响。结果如下: 1.miR206可以显著抑制基底动脉平滑肌细胞的容积调节性氯电流。 在等渗条件下,原代分离培养的大鼠基底动脉平滑肌细胞的基础电流在±100mV时分别为:3.2±1.1pA·pF-1和-1.4±0.6 pA·pF-1,低渗刺激后细胞±100mV时的电流密度增加至63.4±6.2 pA·pF-1和-27.0±5.9 pA·pF-1(n=6)。pBABE miR206慢病毒感染可以使大鼠基底动脉平滑肌细胞的基础电流有所减小,但差异无明显差异,在±100mV时电流分别为:2.6±1.3 pA·pF-1和-1.1±0.5pA·pF-1(n=8,p>0.05 versus control group);pBABE miR206慢病毒感染亦可以使大鼠基底动脉平滑肌细胞的低渗刺激诱导的容积调节性氯电流明显减小,在±100mV电流分别为:30.4±3.5 pA·pF-1和-9.6±2.6pA·pF-1(n=8,p<0.01)。pBABE空载体慢病毒感染对大鼠基底动脉平滑肌细胞的在等渗状态下的基础电流和低渗刺激下容积调节性氯电流皆没有影响(n=6,p>0.05 versus control group)。 2.miR206可以显著抑制基底动脉平滑肌细胞的容积调节性氯运动。 大鼠基底动脉平滑肌细胞在等渗时细胞内氯离子浓度为30.9±0.7 mM(n=30),低渗刺激可诱导细胞内氯离子外流,细胞内氯离子浓度下降到22.8±1.7mM(n=30)。pBABE miR206慢病毒感染对大鼠基底动脉平滑肌细胞的在等渗时细胞内氯离子浓度无明显影响,30.8±0.5 mM(n=30,p>0.05 versuscontrol group):在低渗刺激下,pBABE miR206慢病毒感染的大鼠基底动脉平滑肌细胞的细胞内氯离子浓度下降至27.2±1.8mM,较对照组明显升高(n=30,p<0.01 versus control group)。pBABE空载体慢病毒感染对大鼠基底动脉平滑肌细胞的在等渗状态下的细胞内氯离子浓度和低渗刺激下细胞内氯离子浓度皆没有明显影响(n=30,p>0.05 versus control group)。 小结 1.miR206可以显著抑制基底动脉平滑肌细胞的容积调节性氯电流。 2.miR206可以显著抑制基底动脉平滑肌细胞的容积调节性氯运动。 第三部分 miR206对基底动脉平滑肌细胞增殖的影响 第一、二部分研究发现miR206通过靶向调控CLC-3从而调节基底动脉平滑肌细胞容积调节性氯通道的功能。我们实验室前期实验证实CLC-3可以促进血管平滑肌细胞增殖,参与高血压脑血管重构。本章进一步研究miR206对AngiotensinⅡ诱导的基底动脉平滑肌细胞增殖的影响;并在AngiotensinⅡ皮下微泵灌注诱导的高血压小鼠模型上观察在重构基底动脉上miR206和CLC-3的表达变化。结果如下: 1.AngiotensinⅡ可以下调基底动脉平滑肌细胞miR206的表达 0.5μM AngiotensinⅡ处理24h可以显著降低基底动脉平滑肌细胞的miR206的表达。 2.AngiotensinⅡ可以上调基底动脉平滑肌细胞CLC-3 mRNA和蛋白的表达 0.5μM AngiotensinⅡ处理24h可以显著增强基底动脉平滑肌细胞的CLC-3 mRNA和蛋白的表达。 3.miR206可以显著抑制AngiotensinⅡ诱导的基底动脉平滑肌细胞增殖, CLC-3质粒瞬时转染可以部分逆转miR206对细胞增殖的抑制作用。 BrdU掺入实验显示,以空白对照组为100%,0.5μM AngiotensinⅡ处理24h可以使细胞增殖率增加至127.1±2.4%pBABE空载体慢病毒对细胞增殖没有明显影响,而pBABE miR206慢病毒感染可以使AngiotensinⅡ诱导的细胞增殖下降至106.8±2.8(n=6,P<0.05 versus AngⅡ group)。CLC-3质粒瞬时转染可以部分逆转miR206对细胞增殖的抑制作用,细胞增殖率为115.2±2.0(n=6,P<0.05 versus miR206+AngⅡ group)。 4.AngiotensinⅡ皮下微泵灌注诱导的高血压小鼠基底动脉出现明显重构。 AngiotensinⅡ皮下微泵灌注(1.5mg/kg/d;14 days)可以使小鼠血压达到159.0±12.8 mmHg,较对照组91.2±9.7 mmHg明显升高(n=9,P<0.05);AngⅡ组小鼠基底动脉出现明显重构,基底动脉外径为135.72±3.61μm,较对照组146.92±45.78μm明显减小(n=4,P<0.05);AngⅡ组基底动脉内径为119.29±4.51μm,较对照组137.31±5.28μm明显减小(n=4,P<0.05)。AngⅡ组基底动脉中层厚度7.97±0.62μm,较对照组5.71±0.38μm显著增加。AngⅡ组基底动脉管径管腔比为0.073±0.006,较对照组0.041±0.004明显增加(n=4,P<0.05)。AngⅡ组脑基底动脉中层面积达到3361.4±182.4μm2,较对照组2349.24±128.9μm2明显增加(n=4,P<0.05) 5.AngiotensinⅡ皮下微泵灌注诱导的高血压小鼠基底动脉上miR206表达降低,CLC-3的mRNA表达升高。 AngⅡ组基底动脉miR206的相对表达量为0.37±0.13,较对照组1.0±0.17明显降低(n=5,P<0.01);AngⅡ组基底动脉CLC-3 mRNA的相对表达量为3.50±0.71,较对照组1.0±0.14明显升高(n=5,P<0.01) 小结 1.AngiotensinⅡ可以使基底动脉平滑肌细胞miR206表达下降,CLC-3mRNA和蛋白的表达升高。 2.miR206可以显著抑制AngiotensinⅡ诱导的基底动脉平滑肌细胞增殖,CLC-3质粒瞬时转染可以部分逆转miR206对细胞增殖的抑制作用。 3.AngiotensinⅡ皮下微泵灌注可诱导的高血压小鼠基底动脉出现明显重构,使基底动脉miR206表达下降,CLC-3mRNA表达升高。 结论 1.miR206通过与CLC-3 mRNA3’-UTR特异性的互补结合从而靶向调控CLC-3的表达及影响CLC-3编码的容积调节性氯通道活性。 2.miR206可以抑制AngiotensinⅡ诱导的基底动脉平滑肌细胞增殖,其对增殖的抑制作用至少部分与其对CLC-3的靶向调控作用有关。 3.AngiotensinⅡ皮下微泵灌注诱导的高血压小鼠重构基底动脉,miR206表达下降,CLC-3mRNA表达升高。miR206对CLC-3的靶向调控可能参与了高血压脑血管重构。