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西瓜(Citrullus lanatus)是世界重要的经济作物之一,在我国广泛种植。干旱、盐害、高温等胁迫是影响其产量和品质常见的三大非生物因素,三者均会在一定程度上造成使细胞水分匮乏,从而对西瓜产生渗透胁迫。虽有大量研究表明,海藻糖作为一种重要的渗透调节物质,可以有效提高多种植物的抗逆性。但海藻糖对西瓜生产中经常面临的渗透胁迫是否有缓解作用?渗透胁迫下西瓜通过什么信号通路启动海藻糖合成?围绕以上科学问题,本研究选取二倍体西瓜悬浮培养细胞为试验材料,通过对不同处理条件下西瓜细胞的表型特征测定、海藻糖合成代谢家族基因进行生物信息学分析、基因表达量分析和海藻糖积累量测定,以此明确海藻糖与西瓜渗透胁迫抗性之间的关系,建立逆境信号物质、海藻糖合成代谢途径基因表达与海藻糖含量的相关性,探究渗透胁迫下西瓜启动海藻糖生物合成的信号转导通路。主要研究结果如下:(1)外源海藻糖预处理后,对渗透胁迫下西瓜悬浮培养细胞生长量、细胞外pH、细胞内ROS(活性氧簇)相对含量和微管骨架的测定。结果发现:渗透胁迫下西瓜细胞的生长量明显受到抑制,并且渗透胁迫可诱导西瓜悬浮培养细胞质外体碱化,ROS进发,细胞微管骨架发生解聚;而外源添加海藻糖可在一定程度上缓解渗透胁迫对西瓜悬浮细胞生长量的抑制作用,调节pH、ROS表达水平,并维持微管骨架结构的完整性。(2)植物中海藻糖由海藻糖-6-磷酸合酶(TPS)和海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶(TPP)催化合成;此外,海藻糖在海藻糖酶(TRE)的作用下还原为葡萄糖。从葫芦科基因组数据库(CGD)中获取西瓜中海藻糖ClTPS、ClTPP、ClTRE家族基因相关序列,通过PFAM和SMART工具进行蛋白结构域的鉴定得到7个ClTPS、7个ClTPP蛋白、3 个 ClTRE 蛋白,分别对其命名为 ClTPS1-ClTPS7;ClTPP1-Cl TPP7;ClTRE1-ClTRE3。(3)通过对西瓜中海藻糖合成代谢家族基因进行生物信息学分析发现:西瓜中ClTPS家族基因分为Class Ⅰ和Class ⅡⅡ两类,Class 1包含有2个基因(ClTPS2,ClTPS7),其余为Class Ⅱ,同一亚家族的蛋白理化性质和基因结构较为相似;染色体定位分析发现,除ClTRE基因外,西瓜ClTPS、ClTPp家族基因成员均单个分布在11条染色体上,没有串联重复的现象;信号肽和磷酸化位点分析西瓜17个西瓜蛋白均为非分泌蛋白,不参与蛋白质在细胞内转运,且西瓜ClTPS、ClTPP、ClTRE家族蛋白磷酸化位点多集中在丝氨酸位点;系统进化分析TPS和TPP家族基因在进化过程中出现成倍扩增,而TRE家族基因在进化过程相对保守。(4)海藻糖合成代谢家族基因启动区顺式作用元件预测发现,它们除了包含一些必要的顺式作用元件外,同时包含很多响应逆境及植物激素相关的顺式作用元件。(5)外源甘露醇模拟渗透胁迫处理西瓜悬浮细胞,结果发现渗透胁迫均可以不同时间不同程度上诱导西瓜细胞海藻糖ClTPS、ClTPP、ClTRE家族基因表达量升高,并促进西瓜细胞海藻糖的积累。(6)西瓜悬浮细胞中ClTPS、ClTPP、ClTRE家族基因表达量和海藻糖积累量均能对外源植物激素(MeJA、ETH、ABA、SA)不同程度地做出响应;其中外源MeJA诱导处理后西瓜ClTPS家族基因表达量最高;外源MeJA和ETH诱导处理后西瓜ClTPP和ClTTRE家族基因表达量较高;但对诱导后的西瓜细胞进行海藻糖含量测定发现:对照组没有海藻糖检出,ABA、MeJA、乙烯利和SA都可以诱导西瓜细胞海藻糖积累,其中MeJA诱导下海藻糖积累量最高,ABA、SA次之,乙烯利最低。(7)西瓜悬浮细胞中ClTPS、ClTPP、ClTRE家族基因表达量对茉莉酸合成抑制剂IBU、乙烯合成抑制剂AVG、脱落酸合成抑制剂FL不同程度地做出响应,其中西瓜中ClTPS家族基因的表达受内源茉莉酸和脱落酸合成的调控,西瓜中大部分ClTPP家族基因的表达受内源茉莉酸和脱落酸合成的调控,西瓜中ClTRE家族基因的表达受脱落酸合成的调控,而内源乙烯的合成负反馈调控西瓜ClTPS、ClTpP、ClTTRE家族基因的表达;对诱导后的西瓜细胞进行海藻糖含量测定发现:与甘露醇处理组相比,不同内源信号分子抑制剂对西瓜细胞海藻糖的积累均有抑制作用,其中茉莉酸合成受抑制时,海藻糖积累量明显下降。(8)外源添加激素(ABA、MeJA、乙烯利、SA)诱导西瓜细胞,结果发现:不同外源植物激素也均对西瓜悬浮细胞的生长量有一定程度的抑制作用,其中,茉莉酸甲酯(MeJA)对西瓜细胞的生长量抑制作用最小;乙烯(ETH)、脱落酸(ABA)次之;水杨酸(SA)对西瓜悬浮细胞生长量的抑制作用最大。(9)外源添加甘露醇、茉莉酸合成抑制剂(Ibuprofen,IBU)、乙烯合成抑制(AVG)、脱落酸合成抑制剂(FL)诱导西瓜细胞,结果发现:甘露醇胁迫条件下,西瓜细胞的生长量显著下降;与甘露醇胁迫相比,添加IBU和FL预处理后,其对渗透胁迫下细胞的生长量均有显著的抑制作用;添加AVG预处理后,虽对渗透胁迫下西瓜的生长量有抑制作用,但与甘露醇胁迫条件下相比没有显著性差异。综上所述,外源添加海藻糖可以提高西瓜细胞对渗透胁迫的抗逆性,渗透胁迫下西瓜细胞内源海藻糖的积累与植物激素信号密切相关,其中茉莉酸信号可能在西瓜海藻糖合成信号通路中起到主导作用。