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第一部分ROCK抑制剂对牛角膜内皮细胞球注射移植的影响目的:3D球形培养和ROCK抑制剂对提高细胞活力,促进细胞增殖有很好的作用,本研究的目的是探索ROCK抑制剂对牛角膜内皮细胞(B-CECs)在体外的生长,可注射移植,以及球形3D培养的影响。方法:采用胰酶消化法从屠宰场获得的牛眼球中分离得到原代角膜内皮细胞(B-CEC),采用多细胞微球具模型进行B-CEC的球形培养并利用细胞死活染色、Ed U染色和CCK-8检测评估ROCK抑制剂对B-CEC球与B-CECs增殖和活性的影响。利用体外可注射移植实验分析ROCK抑制剂对B-CEC球在细胞培养板和仿生脱细胞角膜贴壁能力的影响,倒置显微镜和扫描电镜观察细胞形态。结果:免疫荧光染色表明Y-23672不改变CECs的表型,但通过细胞死活染色实验、Ed U染色实验和CCK-8增殖实验发现Y-23672可以显著提高B-CECs与B-CEC球细胞的活性和增殖。采用多细胞微球具模型形成大小均匀的B-CEC球比单散CECs有更高分化潜能。体外模拟移植可注射性实验显示,经Y-23672处理的成球一天移植到细胞板或脱细胞角膜贴壁5天的B-CEC球可以贴壁完全并成铺路石样的单层细胞,而无Y-23672处理的对照组B-CEC球接种后仍有细胞聚集。结论:与2D培养相比较,3D培养法能使B-CEC球有更高的分化潜能;ROCK抑制剂可以提升球形培养B-CEC的活力,促进球形培养的B-CEC的增殖、迁移,且不改变B-CEC固有的基因和蛋白的表达;我们的研究结果表明3D琼脂糖球形培养法结合ROCK抑制剂是形成含有角膜内皮前体细胞和体外模拟移植可注射性B-CEC球将为未来CEC的治疗有重要的应用意义。第二部分非基因重编程及生物模拟诱导促进ADSC直接重编程为角膜内皮细胞目的:探索重组蛋白和小分子在模拟微重力条件下对促进脂肪干细胞(ADSC)重编程成为角膜内皮(CEC)样细胞的影响,目标是要了解重组蛋白质,小分子和仿生环境的组合能否为促进脂肪干细胞转分化成为角膜内皮样细胞建立起非基因直接重编程平台系统。方法:使用胶原酶消化法分离原代ADSC,并对细胞进行表型的鉴定。利用带有穿膜肽的重组重编程蛋白PTD-Oct4、PTD-Klf4、PTD-Sox2(PTD-OKS)以及小分子(Purmorphamine,RG108等重编程化合物)在模拟微重力反应器(SMG)中进行ADSC的重编程诱导。重编程后的ADSC在插入式共培养系统与丝裂霉素C处理的CEC以及角膜缘基质细胞共培养并接种到脱细胞牛角膜基质进一步培养,RT-PCR和免疫荧光鉴定直接重编程后细胞的基因、蛋白表达情况。结果:通过流式细胞术,成脂成骨分化法鉴定ADSC。使用带穿膜肽的重组重编程蛋白PTD-Oct4、PTD-Klf4、PTD-Sox2(PTD-OKS)以及小分子(Purmorphamine,RG108等重编程化合物)在模拟微重力反应器(SMG)中诱导后,RT-PCR和免疫荧光分析表明ADSCs阳性表达Nanog和CD34。共培养后的ADSC接种到脱细胞角膜上成熟后,细胞形态由纺锤样变为多角形;免疫荧光显示直接重编程后的ADSCs弱阳性表达CD31、AQP-1、ZO-1。结论:ADSC经过重组蛋白与小分子在模拟微重力条件下重编程诱导后,具有更高的分化潜能;与CEC以及角膜基质细胞共培养分化后接种到脱细胞角膜上呈现铺路石样六角形细胞形态,且阳性表达角膜内皮标志物CD31、AQP-1、ZO-1。这些发现初步实现了ADSC直接重编程为CEC。我们的研究也首次表明SMG旋转式细胞培养系统可以用作非基因手段促进直接重编程。非基因重编程为特异性多能干细胞的可塑性研究和未来自体CEC替代疗法提供了新的选择,从而避免了使用多能干细胞疗法引起的并发症的发生。