特发性肺间质纤维化（Idiopathic Pulmonary Fibrosis,IPF）是一种原因不明,以普通型间质性肺炎为特征的慢性纤维化性肺疾病。其中位生存期短,预后差。近10年来,IPF的发病率逐年升高,严重危害人类健康,现有的药物有吡非尼酮、尼达尼布虽能缓解肺功能,但不能降低其死亡率。IPF出现蜂窝状改变的主要病理表现是:肺间质炎症细胞浸润,肌成纤维细胞增多,肺泡结构破坏,细胞外基质积聚。目前尚无有效手段阻止其病理进展。因此,解析IPF进展机制,寻求新的有效干预策略,对降低发病率、死亡率有重大意义。肺间质肌成纤维细胞不断增多及微血管损毁是IPF进展的重要病理改变。目前肌成纤维细胞的来源尚未明确、争议较大:研究结果显示其来源包括骨髓来源的成纤维细胞、肺泡上皮细胞、内皮细胞、周细胞、间质原位成纤维细胞等。以往十几年的主流观点“肺泡上皮细胞-间充质转分化”因其在体内实验无法再现越来越受到质疑。新近学者们应用遗传命运图谱技术发现:周细胞是肺间质肌成纤维细胞的主要来源。周细胞活化后的一个重要效应是:转化为肌成纤维细胞,促进细胞外基质合成,促进纤维化进展。周细胞活化后的另一个效应是:周细胞从内皮游离,导致微血管损毁,组织缺血,诱发低氧-氧化应激损伤,加重IPF进展。由此可推测,周细胞活化是肺间质肌成纤维细胞增多与微血管损毁的连接点!深入研究周细胞被活化的机制及其活化后所导致的重要分子生物学效应将为IPF的治疗提供新研究思路和干预策略。研究表明包括肺泡上皮细胞、血管内皮细胞和巨噬细胞在内的多种细胞分泌细胞因子如TGF-β1、PDGF等配体,进而活化周细胞TGF-β、PDGF等信号通路及下游的蛋白发生磷酸化,最终诱导周细胞活化。上述研究表明:多条信号通路的过度激活是周细胞活化发生和维系的重要基础。能否找到控制它们活性的共同靶点呢?分析上述信号通路的受体蛋白不难发现:TGFβR、PDGFβR均为糖蛋白,必需有糖基化修饰才能发挥其生理功能。核心岩藻糖基化（CF）是重要的蛋白质糖修饰,是由α-1,6岩藻糖基转移酶（FUT8）特异性地催化转移岩藻糖,将其连接在靶蛋白的特定氨基酸位点的核心糖链上,从而完成靶蛋白质的折叠、空间构象。对蛋白质分子识别、细胞间通讯、信号通路活化等功能有必不可少的调控功能。我们课题组前期研究已经发现:FUT8催化的CF修饰在博来霉素（BLM）致小鼠IPF模型中扮演重要角色,干预CF修饰后可以改善小鼠肺脏病理。由此我们推测周细胞活化可能是IPF的形成和发展的核心事件,CF可能是调控多条信号通路致周细胞活化的重要靶点,抑制CF修饰可能阻断周细胞活化致IPF的进展。然而,在周细胞活化中CF修饰的特征性改变是什么?周细胞活化的关键蛋白是否受到CF修饰?抑制CF修饰能否逆转周细胞活化?这些都是尚未解决的科学问题。为解决上述科学问题,我们将实验分为两部分进行深入研究:第一部分阐明CF修饰对周细胞活化的影响,试图解析其分子机制。第二部分明确CF修饰是抑制IPF进展的潜在靶点。综上,我们提出并验证“CF修饰是调控IPF发生和进展的关键环节”的学术观点,为基础医学向临床医学转化奠定理论基础。第一部分CF修饰是周细胞活化的关键靶点目的:观察CF修饰在周细胞活化中的特征性变化,初步解析CF修饰对周细胞活化的影响。方法:建立BLM（5mg/kg）致IPF 28d小鼠模型,采用PDGFβR,NG2作为周细胞标记物,用CD31标记肺脏毛细血管内皮细胞,用α-SMA作为肌成纤维细胞标记物,LCA表示核心岩藻糖基化修饰水平。采用免疫荧光共染的方法观察周细胞迁移及转化的现象（即PDGFβR-CD31;NG2-CD31;PDGFβR-NG2;PDGFβR-α-SMA分别标记）。进一步合成FUT8^-/+半敲鼠,分别标记PDGFβR-CD31;NG2-CD31;PDGFβR-NG2;PDGFβR-α-SMA,观察CF修饰对周细胞迁移转化的影响。进一步利用免疫荧光检测周细胞活化过程与CF修饰的关系（即PDGFβR–LCA,α-SMA–LCA）。结果:（1）在WT组中PDGFβR、NG2与CD31的表达相重叠,周细胞未发生迁移;而在BLM 28d组中,PDGFβR、NG2与CD31分别出现分离现象,肺间质出现PDGFβR、NG2的表达;而利用FUT8^-/+建立BLM致IPF小鼠模型,PDGFβR、NG2标记的周细胞并未显现出与CD31分离现象,说明FUT8^-/+小鼠抑制CF修饰后可阻断BLM致周细胞向肺间质迁移。（2）在WT组中,利用PDGFβR标记小鼠肺脏周细胞,肺间质并未出现α-SMA蛋白的表达;而在BLM 28d模型组中,肺间质出现了PDGFβR标记肺脏周细胞,α-SMA表达显著增加;而利用FUT8^-/+建立BLM致IPF小鼠模型,PDGFβR标记的周细胞并未出现在肺间质中,α-SMA表达显著降低,说明FUT8^-/+小鼠抑制CF修饰后可阻断BLM致周细胞向肌成纤维细胞转化。（3）与对照组相比,在BLM28d组中PDGFβR标记的小鼠肺脏周细胞与LCA共染结果可见两者荧光强度显著增强;而在肺间质中a-SMA与LCA共染荧光强度也显著增强;利用FUT8^-/+建立BLM致IPF小鼠模型中,a-SMA与LCA共染荧光强度显著减弱。这说明在BLM致周细胞活化过程中伴有CF修饰现象,抑制CF修饰可阻断周细胞向肌成纤维细胞转化。结论:在BLM致小鼠周细胞活化过程中存在CF修饰现象;抑制CF修饰可阻断周细胞迁移及转化。第二部分CF修饰对特发性肺纤维化进程的影响目的:明确CF修饰是治疗IPF的潜在靶点。方法:1、根据实验需求,实验设计共分3组:（1）正常对照组（WT）:正常野生型C57BL/6小鼠。（2）模型组（BLM 28d）:向4-6周雄性野生型C57BL/6小鼠气管内注射BLM,28d后根据实验需求观察实验结果。（3）干预组(FUT8^-/++BLM28d):利用构建的FUT8基因半敲除小鼠,气管内注射BLM,28d后根据实验需求观察实验结果。2、利用免疫印迹检测进行荧光量化,观察FUT8^-/+半敲鼠抑制CF修饰后能否减轻小鼠肺脏肌成纤维细胞的聚集。3.利用HE和Masson染色来观察各组小鼠肺组织病理改变。4.通过免疫组化检测细胞外基质主要组分胶原Ⅰ和胶原Ⅲ的表达情况。结果:（1）免疫印记法检测到BLM28d组与WT组相比,a-SMA和FUT8的表达量显著增强,利用FUT8^-/+建立BLM致IPF小鼠模型中,上述蛋白表达水平下降。（2）HE和Masson染色观察到BLM28d组与WT组相比,表现出典型的纤维化现象:肺泡正常结构被破坏,肺间质内有大量炎细胞的浸润,宽度明显增加,蓝染的胶原纤维增多。利用FUT8基因半敲除小鼠造模后,可以发现肺脏纤维化程度显著减轻,肺脏结构基本稳定,炎症细胞及蓝染的胶原纤维明显减少。（3）免疫组化结果显示,胶原蛋白Ⅰ和胶原蛋白Ⅲ在BLM28d造模组中表达明显增加,利用FUT8基因半敲除小鼠造模后,胶原蛋白Ⅰ和胶原蛋白Ⅲ在肺脏中的表达显著减少。结论:IPF与CF的异常表达相关联,抑制CF对肺间质纤维化有保护作用。