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肿瘤抗原特异性细胞毒性的T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)特异性强、杀伤活性高、毒性作用小,成为肿瘤生物治疗的一个热点,然而传统的过继免疫治疗因最终浸润至肿瘤局部的淋巴细胞数目有限,并受到肿瘤微环境的阻碍,使得大多数杀伤细胞失去其效应功能,导致其在临床治疗应用中受到极大的限制,难以高效彻底地清除肿瘤细胞。因此在肿瘤抗原特异性CTL过继治疗领域,如何靶向募集足量的肿瘤特异性CTL到达肿瘤部位以及增强其在肿瘤局部杀伤肿瘤细胞的生物活性成为亟待解决的难题。 目的:构建一种能够特异性结合肿瘤新生血管内皮细胞(mouse tumor vascular endothelial cells,mTEC)趋化肿瘤抗原特异性CTL到达肿瘤局部实现高效抗肿瘤作用的纳米趋化系统(ENG-Apt/mIP-10-LP)。 方法:选择肿瘤局部血管丰富的黑色素瘤作为肿瘤研究模型。通过乙醇和钙离子共沉淀法制备包裹质粒IP-10的纳米脂质体(Liposome Ioaded with IP-10plasmid DNA,LP-mIP-10;通过Post-insertion法将DSPE-PEG2000-ENG-Aptamer连接至LP-mIP-10表面,得到ENG-Apt/mIP-10-LP。利用动态光散射仪(Dynamic Light Scattering Instrument,DLS)及透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope,TEM)对ENG-Apt/mIP-10-LP的粒径大小、形貌以及表面电位进行表征分析。细胞吞噬实验验证ENG-Apt/mIP-10-LP对mTEC的靶向性,细胞转染实验验证ENG-Apt/mIP-10-LP对mTEC的转染能力。人工抗原提呈细胞(H-2Kb-Ig:TRP2-aAPC)诱导TRP2特异性CD8+T细胞,通过磁珠富集TRP2CD8+T细胞。建立C57BL/6小鼠黑色素瘤模型,通过尾静脉注射的方式用EN G-Apt/mIP-10-LP或ENG-Apt/mIP-10-LP联合TRP2CD8+T对荷瘤小鼠进行治疗。活体成像技术研究纳米粒子在荷瘤小鼠体内靶向肿瘤局部的能力。免疫组织化学染色(Immunological Histological Chemistry,IHC)检测局部细胞IP-10蛋白的表达。流式细胞分析术检测荷瘤小鼠肿瘤局部CXCR3+CD8+T细胞与TRP2CD8+T细胞的数目,检测小鼠体内骨髓前体抑制细胞(Myeloid-Derived Suppressor Cell,MDSC)与调节性T细胞(T-regulatory Cell,Treg)的数量。原位四聚体染色法(in situ tetramer staining,ISTS)观察TRP2CD8+T在肿瘤局部的浸润。酶联免疫斑点分析(Enzyme-Linked Immunospot Assay,ELISPOT)及胞内染色法检测细胞分泌干扰素-γ(Interferon-gamma,IFN-γ)阳性细胞数量。免疫组织化学法检测肿瘤局部的血管密度、细胞核增殖及细胞凋亡情况。观察荷瘤小鼠生存时间与肿瘤生长情况,使用公式计算肿瘤体积。 结果:成功制备ENG-Apt/mIP-10-LP,粒径在150nm左右,分布均匀,对细胞毒性小,在血清中相对稳定。ENG-Apt/mIP-10-LP在小鼠黑色素瘤模型中可有效减缓肿瘤生长并延长其生存时间,提高肿瘤局部CD8+T细胞数目并提高脾脏细胞中IFN-γ分泌阳性的细胞数目,降低骨髓、脾脏及肿瘤组织局部细胞中MDSC以及脾脏中Treg的数量,抑制荷瘤小鼠体内肿瘤血管生成及肿瘤细胞增殖,并促进肿瘤细胞凋亡。进一步研究通过ENG-Apt/mIP-10-LP联合TRP2CD8+T细胞在荷黑色素瘤小鼠体内能更有效的减缓肿瘤的生长并延长其生存时间,提高肿瘤浸润性淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte,TIL)中CXCR3+CD8+T细胞及TRP2CD8+T细胞的数量并提高TIL中TRP2特异性IFN-γ分泌阳性细胞数目,降低肿瘤组织局部细胞中MDSC及TIL中Treg的数量,进一步抑制荷瘤小鼠体内肿瘤微血管生成及肿瘤细胞增殖,并促进肿瘤细胞凋亡。 结论:ENG-Apt/mIP-10-LP为免疫细胞治疗提供一种具有诱人应用前景的靶向趋化系统。