论文部分内容阅读
党参是传统道地药材，具有补中益气，健脾益肺之功效，将其与其他药材合理配伍开发成保健类口服液制品具有广泛的市场前景。党参多糖作为党参中的主要功效成分之一，研究表明其具有免疫调节、抗氧化、抗肿瘤等活性。在党参口服液制备过程中，发现传统的高压灭菌生产工艺会导致党参口服液中的多糖含量有大幅下降，该下降是否伴随着多糖的结构和活性的改变关系到口服液产品的品质以及功效的发挥，因此研究高压灭菌工艺对党参口服液中多糖的结构及活性的影响具有重要的意义。
本文通过探讨不同品种党参的固形物提取率、多糖提取率以及高压灭菌对不同品种党参口服液中多糖的影响，首先确定合适的试验研究原料；采用醇沉、超滤截留、凝胶柱层析对高压灭菌前后党参口服液中的多糖进行分离纯化，并结合活性追踪获得活性多糖以及精制多糖组分；采用化学法、光谱法以及色谱法等对精制多糖组分的结构进行解析；最后利用RAW264.7免疫调节模型以及小鼠脾细胞增殖模型评价高压灭菌前后党参口服液中多糖的免疫活性。以期研究高压灭菌对党参口服液中多糖的结构以及免疫活性的影响。具体研究内容和结果如下：
（1）不同品种党参的筛选。选取渭党、党参段、素花党参、板桥党参、川党参五种原料，考察其固形物提取率、多糖提取率以及高压灭菌对不同品种党参口服液中多糖的影响。五种党参原料的固形物提取率依次为47.09%、46.54%、29.88%、25.93%、29.21%，多糖提取率依次为13.88%、13.12%、11.11%、3.36%、11.28%。将五种原料提取、浓缩、配制成口服液，经过高压灭菌处理后各品种党参口服液的多糖下降量依次为31.68%、30.20%、52.73%、40.90%、11.16%。综上可知，渭党的固形物提取率和多糖提取率均优于其他品种，且经过高压灭菌后其口服液中的多糖下降量达到31.68%，对于研究高压灭菌处理对党参口服液中多糖的影响具有一定的代表性，因此选择渭党原料进行进一步的试验。
（2）高压灭菌前后党参口服液中活性多糖的分离纯化。采用醇沉处理得到高压灭菌前后党参口服液的粗多糖组分，其中，灭菌前粗多糖样品（COP）中的多糖含量为71.28%，蛋白质含量为0.52%，对应灭菌后粗多糖样品（HCOP）中的分别为62.09%和1.29%，因粗多糖中的蛋白含量对后续纯化的影响较小，所以不进行脱蛋白处理。采用超滤截留分离将COP分离为组分COP-1和COP-2，将HCOP分离为组分HCOP-1和HCOP-2，COP-1、COP-2、HCOP-1、HCOP-2的得率依次为4.06%、22.41%、5.61%、15.91%，多糖含量依次为35.20%、69.03%、42.00%、69.30%，并进行活性评价以得到高活性组分。采用凝胶柱层析法将COP-2纯化为精制多糖组分COP-2-1、COP-2-2，将HCOP-2纯化为精制多糖组分HCOP-2-1、HCOP-2-2，四种精制多糖组分的得率依次为15.67%、5.13%、12.26%、7.51%，多糖含量依次为99.7%、84.8%、98.6%、90.7%。
（3）灭菌前后党参口服液中精制多糖的结构解析。采用化学法、光谱法以及色谱法等对COP-2-1、COP-2-2、HCOP-2-1、HCOP-2-2的结构进行解析。高效凝胶渗透色谱（HPGPC）结果表明四种多糖为对称单一峰。气质联用仪（GC-MS）分析其单糖组成可知，COP-2-1的葡萄糖的摩尔比低于HCOP-2-1， COP-2-2的葡萄糖的摩尔比低于HCOP-2-2；红外扫描结果可知，COP-2-1、HCOP-2-1、HCOP-2-2具有糖醛酸的特征吸收峰，间羟联苯法测定COP-2-1、COP-2-2、HCOP-2-1、HCOP-2-2的糖醛酸含量依次为7.6%、4.7%、9.1%、9.2%；高碘酸氧化和Smith降解分析其糖苷键类型可知，与COP-2-1、COP-2-2相比，HCOP-2-1、HCOP-2-2中不含1→6键，且1→2和1→4键所占比例有所增加；原子力显微镜（AFM）分析多糖的形貌特征可知，与COP-2-1、COP-2-2相比，HCOP-2-1与HCOP-2-2并未呈现出多糖链状或是环状的结构，由高度计算结果可知，四种精制多糖的高度依次为15.433、13.099、2.763、8.023 nm，灭菌后多糖的高度明显降低。综上，高压灭菌后口服液多糖的单糖组成、糖醛酸含量、糖苷键类型以及分子形貌特征均发生了一定的改变，推测是高压灭菌导致了多糖链发生不同程度的断裂而引起的差异。
（4）高压灭菌前后党参口服液中多糖的免疫活性评价。通过样品作用于RAW264.7的细胞增殖指数、吞噬指数、NO释放量以及细胞因子（IL-6、IL-1β、TNF-α）的分泌量来评价高压灭菌前后党参口服液中多糖的免疫调节活性。结果表明：采用细胞增殖活性筛选出COP-2和HCOP-2分别为灭菌前后党参口服液中的活性多糖组分，该结果可作为多糖纯化实验中选择纯化组分的判断依据。与COP-2-1相比，HCOP-2-1不同的活性指标下降量在18~30%之间；与COP-2-2相比，HCOP-2-2的NO（35.41%）、IL-6（4.4%）、IL-1β（169.62%）的生成有不同程度的升高，而吞噬作用及 TNF-α的生成的活性有10%左右的下降。采用小鼠脾细胞增殖模型对精制多糖的免疫活性进行评价，结果如下：与COP-2-1相比，HCOP-2-1的单独刺激、协同LPS和ConA刺激小鼠脾细胞的增殖均出现不同程度的下降，下降量在7~30%之间；与COP-2-2相比， HCOP-2-2单独刺激与协同 LPS刺激小鼠脾细胞增殖的活性升高了1.4~2.4%，协同ConA的作用下降了10.82%。综上，高压灭菌会导致口服液中小部分多糖（HCOP-2-2，得率7.51%）活性的部分指标小幅度升高，大部分的多糖活性降低幅度较大（HCOP-2-1，得率12.26%）。因此，高压灭菌会给口服液中多糖的免疫活性带来不利的影响。
本文通过探讨不同品种党参的固形物提取率、多糖提取率以及高压灭菌对不同品种党参口服液中多糖的影响，首先确定合适的试验研究原料；采用醇沉、超滤截留、凝胶柱层析对高压灭菌前后党参口服液中的多糖进行分离纯化，并结合活性追踪获得活性多糖以及精制多糖组分；采用化学法、光谱法以及色谱法等对精制多糖组分的结构进行解析；最后利用RAW264.7免疫调节模型以及小鼠脾细胞增殖模型评价高压灭菌前后党参口服液中多糖的免疫活性。以期研究高压灭菌对党参口服液中多糖的结构以及免疫活性的影响。具体研究内容和结果如下：
（1）不同品种党参的筛选。选取渭党、党参段、素花党参、板桥党参、川党参五种原料，考察其固形物提取率、多糖提取率以及高压灭菌对不同品种党参口服液中多糖的影响。五种党参原料的固形物提取率依次为47.09%、46.54%、29.88%、25.93%、29.21%，多糖提取率依次为13.88%、13.12%、11.11%、3.36%、11.28%。将五种原料提取、浓缩、配制成口服液，经过高压灭菌处理后各品种党参口服液的多糖下降量依次为31.68%、30.20%、52.73%、40.90%、11.16%。综上可知，渭党的固形物提取率和多糖提取率均优于其他品种，且经过高压灭菌后其口服液中的多糖下降量达到31.68%，对于研究高压灭菌处理对党参口服液中多糖的影响具有一定的代表性，因此选择渭党原料进行进一步的试验。
（2）高压灭菌前后党参口服液中活性多糖的分离纯化。采用醇沉处理得到高压灭菌前后党参口服液的粗多糖组分，其中，灭菌前粗多糖样品（COP）中的多糖含量为71.28%，蛋白质含量为0.52%，对应灭菌后粗多糖样品（HCOP）中的分别为62.09%和1.29%，因粗多糖中的蛋白含量对后续纯化的影响较小，所以不进行脱蛋白处理。采用超滤截留分离将COP分离为组分COP-1和COP-2，将HCOP分离为组分HCOP-1和HCOP-2，COP-1、COP-2、HCOP-1、HCOP-2的得率依次为4.06%、22.41%、5.61%、15.91%，多糖含量依次为35.20%、69.03%、42.00%、69.30%，并进行活性评价以得到高活性组分。采用凝胶柱层析法将COP-2纯化为精制多糖组分COP-2-1、COP-2-2，将HCOP-2纯化为精制多糖组分HCOP-2-1、HCOP-2-2，四种精制多糖组分的得率依次为15.67%、5.13%、12.26%、7.51%，多糖含量依次为99.7%、84.8%、98.6%、90.7%。
（3）灭菌前后党参口服液中精制多糖的结构解析。采用化学法、光谱法以及色谱法等对COP-2-1、COP-2-2、HCOP-2-1、HCOP-2-2的结构进行解析。高效凝胶渗透色谱（HPGPC）结果表明四种多糖为对称单一峰。气质联用仪（GC-MS）分析其单糖组成可知，COP-2-1的葡萄糖的摩尔比低于HCOP-2-1， COP-2-2的葡萄糖的摩尔比低于HCOP-2-2；红外扫描结果可知，COP-2-1、HCOP-2-1、HCOP-2-2具有糖醛酸的特征吸收峰，间羟联苯法测定COP-2-1、COP-2-2、HCOP-2-1、HCOP-2-2的糖醛酸含量依次为7.6%、4.7%、9.1%、9.2%；高碘酸氧化和Smith降解分析其糖苷键类型可知，与COP-2-1、COP-2-2相比，HCOP-2-1、HCOP-2-2中不含1→6键，且1→2和1→4键所占比例有所增加；原子力显微镜（AFM）分析多糖的形貌特征可知，与COP-2-1、COP-2-2相比，HCOP-2-1与HCOP-2-2并未呈现出多糖链状或是环状的结构，由高度计算结果可知，四种精制多糖的高度依次为15.433、13.099、2.763、8.023 nm，灭菌后多糖的高度明显降低。综上，高压灭菌后口服液多糖的单糖组成、糖醛酸含量、糖苷键类型以及分子形貌特征均发生了一定的改变，推测是高压灭菌导致了多糖链发生不同程度的断裂而引起的差异。
（4）高压灭菌前后党参口服液中多糖的免疫活性评价。通过样品作用于RAW264.7的细胞增殖指数、吞噬指数、NO释放量以及细胞因子（IL-6、IL-1β、TNF-α）的分泌量来评价高压灭菌前后党参口服液中多糖的免疫调节活性。结果表明：采用细胞增殖活性筛选出COP-2和HCOP-2分别为灭菌前后党参口服液中的活性多糖组分，该结果可作为多糖纯化实验中选择纯化组分的判断依据。与COP-2-1相比，HCOP-2-1不同的活性指标下降量在18~30%之间；与COP-2-2相比，HCOP-2-2的NO（35.41%）、IL-6（4.4%）、IL-1β（169.62%）的生成有不同程度的升高，而吞噬作用及 TNF-α的生成的活性有10%左右的下降。采用小鼠脾细胞增殖模型对精制多糖的免疫活性进行评价，结果如下：与COP-2-1相比，HCOP-2-1的单独刺激、协同LPS和ConA刺激小鼠脾细胞的增殖均出现不同程度的下降，下降量在7~30%之间；与COP-2-2相比， HCOP-2-2单独刺激与协同 LPS刺激小鼠脾细胞增殖的活性升高了1.4~2.4%，协同ConA的作用下降了10.82%。综上，高压灭菌会导致口服液中小部分多糖（HCOP-2-2，得率7.51%）活性的部分指标小幅度升高，大部分的多糖活性降低幅度较大（HCOP-2-1，得率12.26%）。因此，高压灭菌会给口服液中多糖的免疫活性带来不利的影响。