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喉癌作为当今社会仅次于肺癌的呼吸道恶性肿瘤,其发生发展与多种因素有关。虽然随着医学不断进步,喉癌的治疗手段日渐先进,但是喉癌仍以手术切除为主,而手术将严重影响患者的生活质量。因此,深入探究喉癌的具体发病机制,寻找切实有效的预防手段和治疗方法是当前急需解决的根本问题。DNA甲基化（DNA methylation）是指基因组Cp G二核苷酸在DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase,DNMT）的作用下在其胞嘧啶的5号碳位以共价键的形式结合一个甲基基团。DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰,能够在不改变基因组DNA序列的条件下,改变基因的表达,而表观遗传修饰还包括组蛋白修饰和RNA干扰等。有研究报道,DNA甲基化不仅能够改变染色质构象和DNA与蛋白质相互作用方式,还会影响DNA的稳定性,从而调控基因表达[1]。组蛋白乙酰化（Histone Acetylation）是另一种调控生物遗传表现的表观遗传修饰形式。它是指组蛋白赖氨酸残基在组蛋白乙酰化转移酶（Histone acetyltransferase,HAT）的作用下发生乙酰化,可以通过改变染色质的空间构象,最终促进基因的表达。组蛋白去乙酰化酶（Histone deacetylases,HDAC）则发挥相反的作用,使组蛋白去乙酰化,抑制相关基因的转录。组蛋白去乙酰化酶1（Histone deacetyl-lases 1,HDAC1）是存在于哺乳动物体内重要的转录调节因子,具有调节核小体结构改变,维持组蛋白乙酰化和去乙酰化平衡以及调控基因转录等作用。甲基化Cp G结合蛋白2（Methyl-Cp G-binding protein 2,Me CP2）包含由85个氨基酸组成的甲基胞嘧啶结合结构域（Methyl cytosine binding domain,MBD）,以及由104个氨基酸组成的转录抑制结构域（Transcriptional inhibition domain,TRD）,MBD形成楔形附着于DNA链上的甲基化Cp G位点,而TRD区域则与SIN3转录调控蛋白家族成员A（SIN3 transcription regulator family member A,Sin3A）反应,募集HDAC[2]。CLDN4（Claudin-4）是CLDNs 27个家族成员之一。本课题组在前期工作中发现,喉癌组织CLDN4表达明显低于癌旁组织,Me CP2表达明显高于癌旁组织,Me CP2与CLDN4基因启动子存在结合情况;在给予去甲基化试剂5-aza-dc处理后,喉癌Hep-2细胞中CLDN4表达上调,Me CP2与CLDN4启动子结合减少,那么DNA甲基化是否通过Me CP2募集HDAC1进而影响喉癌Hep-2细胞CLDN4的表达,且是否影响细胞间紧密连接及细胞的增殖活性是本研究亟待解决的关键问题。目的:探讨喉癌Hep-2细胞中DNA甲基化下调CLDN4基因表达是否与Me CP2蛋白有关,并进一步明确CLDN4表达下调对Hep-2细胞间紧密连接结构及细胞增殖活性的影响。方法:采用RT-PCR和Western-blot检测5-aza-dc和TSA对喉癌Hep-2细胞中CLDN4表达的影响;采用甲基化特异性PCR（Methylation specific PCR,MSP）法检测5-aza-dc和TSA作用喉癌Hep-2细胞对CLDN4基因DNA甲基化状态的影响;采用CCK8实验和克隆形成实验检测5-aza-dc和TSA对喉癌Hep-2细胞增殖的影响;采用透射电镜技术观察5-aza-dc和TSA作用后喉癌Hep-2细胞间紧密连接的变化;通过Co-IP实验检测Me CP2与组蛋白修饰酶HDAC1的结合情况;通过转染技术沉默喉癌Hep-2细胞中Me CP2,通过Western-blot检测其对CLDN4表达的影响。结果:1.5-aza-dc和TSA单独及联合用药均可上调喉癌Hep-2细胞CLDN4的表达,且联合用药CLDN4表达上调更明显;2.5-aza-dc和TSA单独及联合应用均可使CLDN4启动子区发生部分去甲基化,联合用药与单独用药相比没有明显差异;3.与未加药组相比,5-aza-dc和TSA单独及联合用药后紧密连接数目增加;4.5-aza-dc单独及与TSA联合应用均可抑制喉癌Hep-2细胞的增殖,并且联合应用抑制作用明显强于单独应用。5.喉癌Hep-2细胞中CLDN4启动子区Me CP2可以与HDAC1结合;6.沉默Me CP2之后,喉癌Hep-2细胞中CLDN4表达上调。结论:喉癌Hep-2细胞中DNA甲基化下调CLDN4表达可能与Me CP2募集HDAC1有关;CLDN4表达上调可以抑制Hep-2细胞增殖,并可增加细胞间紧密连接数目。