论文部分内容阅读
目前,核移植效率的低下和克隆动物发育成功率低是影响体细胞克隆技术广泛应用的主要瓶颈。研究认为,产生这些问题的主要原因是供体核染色质与受体卵质之间互作异常、影响体细胞染色质解聚和激活表达程序出现紊乱有关。本试验采用组蛋白去乙酰化酶特异性抑制剂TSA(trychostatin A)能够抑制重构胚早期组蛋白去乙酰化的作用特点,对重构胚发育早期的不同阶段进行TSA处理,观察其对重构胚发育状况的影响,以揭示组蛋白乙酰化＼去乙酰化作用在核内染色质重编程过程中所发挥的作用,进而为阐释重编程过程中后成记忆的修饰和固定机制提供重要依据,同时也试图探寻一条能够提高核移植效率的新途径。试验一:TSA浓度对重构胚发育的影响。本试验旨在选择合适的TSA处理浓度,按照实验设计分成四组不同的TSA浓度,分别为0.5nM、5nM、50nM、500nM,处理时间为10h。结果发现,50nM的TSA浓度的囊胚率(23.96%)要显著高于其他三组(11.76%、14.29%、8.57%)和对照组(11.94%),它们之间差异显著(P＜0.05),说明50nMTSA可以在最小程度伤害重构胚的情况下最大限度的实现对组蛋白去乙酰化酶(HDAC)的抑制,促进组蛋白的乙酰化,从而达到明显提高重构胚发育的目的。试验二:融合阶段组蛋白乙酰化＼去乙酰化对重构胚发育的影响。本试验旨在确定融合阶段组蛋白乙酰化＼去乙酰化对重构胚的核程序重排及其发育效果的影响作用。设计了两组试验,分别为T3K6组和K3K6组。结果显示,K3K6组与T3K6组在二细胞率(81.82%vs83.18%)和囊胚率(18.19%vs21.45%),两个指标差异均不显著(P＞0.05)。说明在融合阶段通过抑制组蛋白去乙酰化作用并不能显著改善重构胚的发育状况,对重构胚的核程序重排并没有直接的作用。试验三:激活阶段组蛋白乙酰化＼去乙酰化对重构胚发育的影响。本试验旨在确定在激活阶段组蛋白乙酰化＼去乙酰化对重构胚的核程序重排及其发育效果的影响。试验设计了三组,分别为K3T6组、K3K6组和T3T6组。结果显示,K3T6和T3T6组的二细胞率(90.52%,91.04%)和囊胚率(29.31%,32.54%)都明显高于K3K6组(80.41%,21.65%)。两者之间差异显著(P＜0.05);而K3T6组和T3T6组之间在二细胞率(90.52%vs91.04%)和囊胚率(29.31%vs32.54%)上的差异则不显著(p＞0.05)。说明在激活阶段通过抑制组蛋白的去乙酰化作用可以明显提高重构胚的发育效率。试验四:延长激活时间和激活阶段TSA处理的时间对重构胚发育的影响。本试验旨在观察不同的激活时间及不同的TSA处理时间是否会对重构胚发育产生影响。共设计四组试验,分别为K2K6组、K2K9组、T2T6组和T2T9组。结果显示,K2K6组和K2K9组在二细胞率(83.51%vs86.89%)及囊胚率(18.56%vs19.67%)上的差异并不显著(P＞0.05);T2T6组和T2T9组之间在二细胞率(87.38%vs88.34%)和囊胚率(31.06%vs34.19%)的发育上的差异也不显著(P＞0.05)。说明延长激活时间和在激活阶段延长TSA的处理时间并不能显著提高重构胚的发育状况。结论:(1)在用TSA处理重构胚时,其浓度以50nM为宜。(2)在重构胚的融合阶段,TSA的处理并没有对重构胚的发育状况产生显著的影响作用,说明在融合阶段组蛋白的脱乙酰化作用对重构胚的发育没有影响。(3)在重构胚的激活阶段,通过TSA的处理可以显著提高重构胚的发育效率,说明该阶段重构胚的激活与TSA诱导的超乙酰化相关。(4)延长激活时间以及激活阶段TSA处理的时间并不能进一步提高重构胚的发育状况。