细交链孢菌酮酸单克隆抗体的制备及其icELISA方法的建立

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细交链孢菌酮酸(Tenuazonic acid)是一种真菌毒素,是链格孢霉(genus Alternaria)产生的有毒代谢产物。大量研究表明,TEA具有多种毒性,主要通过污染谷物、蔬菜和水果,给人类健康带来潜在威胁。目前对于TEA的检测主要采用高效液相串联质谱的方法,这种方法准确、可靠,但是检测过程相对繁琐,操作难度较大。近年来,由于免疫检测法具有灵敏、快速的优点,有利于大量样品的筛查,从而满足实际样品的检测需求,已经成为食品安全研究领域的热点。本研究以TEA为对象,通过合理设计合成半抗原,从而制备了TEA单克隆抗体,并建立了TEA间接竞争酶联免疫检测方法。主要研究内容和结果如下:(1)人工抗原的合成与鉴定。结合细交链孢菌酮酸的特点,在五元环上引入间隔臂合成半抗原,定制合成半抗原TEA-CMO,经质谱和核磁共振技术鉴定,合成成功。通过活泼酯法将半抗原与载体蛋白KLH偶联,制备出人工抗原,经紫外吸收光谱鉴定,最大吸收峰蓝移,表明偶联成功。(2)单克隆抗体的制备。用免疫原TEA-CMO-KLH免疫BALB/c小鼠,第五次免疫后,检测抗血清效价为1:64000,抑制率为94.7%。取小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞进行融合、培养,阳性孔通过有限稀释进行亚克隆,最终获得6株分泌TEA特异性抗体的杂交瘤细胞株。选取其中较好的一株,命名为TEA-a,其分泌抗体效价为1:128000,抑制率为93.7%。向小鼠腹腔注射TEA-a杂交瘤细胞得到腹水,纯化后抗体浓度为6.3 mg/m L,进行后续实验。(3)icELISA方法的建立。建立了TEA间接竞争酶联免疫检测方法,其中抗体浓度为98.42 ng/mL,包被浓度设置为250 ng/mL,反应缓冲液为pH=7.4、0.01 mol/L PBS,不添加吐温和甲醇,一抗反应时间为40 min,二抗反应时间为40 min。优化后的方法检出限为(IC10)为1.00 ng/mL,IC50=18.50 ng/mL,线性检测范围为3.5696.24 ng/mL,与其余7种链格孢霉毒素结构类似物无交叉反应,方法特异性好。果汁、啤酒样品中的添加回收率在85.45%119.65%之间,与HPLC方法检测结果相关性良好(R2=0.9132),表明可以用于实际样品的检测。
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