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猪传染性胸膜肺炎(PCP,Porcine contagious pleuropneumonia)是由猪胸膜肺炎放线杆菌(APP,Actinobacillus pleuropneumoniae)引起高度接触性传染病。目前国外流行主要以血清2型为主,国内经调查还是主要以血清7型为主,部分地区调查发现血清12型为主要流行血清型。现如今市场上预防胸膜肺炎放线杆菌的疫苗主要是1、2、7和1、3、7血清型灭活苗为主,而目前较流行的血清型12还没有相应的疫苗。因此,通过前期实验室筛选出稳定性好、抗原性强和致病力强的血清2型QS-1菌株,血清7型NJ-2菌株和血清12型AH-18菌株,作为制备疫苗的菌株。本研究主要进行了如下试验:(1)经过细菌计数法和600 nm波长下测定其OD600值,测定3株疫苗菌株的生长曲线特性。(2)分别加入使其与TSB-YE菌液混合后浓度为 0.1%、0.2%和 0.3%的甲醛,于灭活后 3 h、4 h、6 h、10 h、12 h、16 h 和 20 h后进行灭活检验,筛选出最佳灭活时间。(3)3株疫苗菌株分别设置6个不同浓度梯度组,同时设置PBS对照组,每组10只6周龄SPF级昆明系雌性小鼠,每只小鼠攻毒0.2 mL相应浓度菌液,根据小鼠攻毒后死亡情况,计算小鼠半数致死量。(4)疫苗菌株在体外大量扩增后,灭活,离心,用PBS洗涤后,调节细菌浓度作为疫苗原液,一份水相,三份油相比例制苗,通过成品检验、无菌检验及安全性检验评价制备的疫苗是否符合标准。(5)为了对比制备的三价灭活疫苗(8801疫苗)与商品化灭活疫苗(1、2、7血清型)的免疫效果,选取150只,随机分为10组,每组15只,其中1-3组为8801免疫组;4-6组为商品化免疫组;7-9组为PBS对照组;第10组则为空白对照组。采用皮下多点注射方式进行一次免疫、二次免疫,于二次免疫14 d后,分别以胸膜肺炎放线杆菌5 LD50的菌株QS-1、菌株NJ-2、菌株AH-18攻毒,从抗体效价检测、保护率、脏器组织荷菌数和病理变化进行效果评价。结果显示:QS-1菌株在4h时细菌活菌数最高,OD600值为0.41;NJ-2菌株在10 h时活菌数最高,OD600值为0.78;AH-18菌株在10 h活菌数最高,OD600值为0.91,3株疫苗菌株在此时活菌数较多。通过甲醛灭活条件筛选出,当甲醛浓度为0.2%,在37℃恒温,150r/min振荡灭活10h,为适合3株菌株的灭活条件。根据改良寇氏法计算可得,QS-1半数致死量为3.35×108CFU/0.2 mL,NJ-2半数致死量为3.49×l08CFU/0.2 mL,AH-18 半数致死量为 1.06× 109CFU/0.2 mL。经过成品检验、无菌检验及安全性检验,制备的APP三价灭活疫苗符合标准。抗体效价方面,两次免疫抗体效价一次比一次升高,但是商品化疫苗对包被12型抗原不产生抗体,抗体效价并未增加。保护力方面,进行QS-1菌株攻毒,8801疫苗组免疫组、商品化免疫组和PBS对照组免疫保护力分别为70%、80%和无保护力;进行NJ-2菌株攻毒,8801疫苗组、商品化疫苗组和PBS对照组的免疫保护力分别是80%、70%和无保护力;进行AH-18菌株攻毒,8801疫苗组为80%,商品化疫苗组与PBS对照组无保护力。荷菌数方面,进行QS-1和NJ-2菌株攻毒,8801免疫组与商品化免疫组的肺脏、肝脏、脾脏和肾脏对应的荷菌数差异不明显(P>0.05),但与PBS对照组有较大差异(P<0.01)。进行AH-18菌株攻毒,8801免疫组与商品化免疫组和PBS对照组的肺脏、肝脏、脾脏和肾脏荷菌数差异明显(P<0.01)。病理变化方面,QS-1与NJ-2菌株攻毒,8801免疫组与商品化免疫组各脏器无特别严重病理变化,AH-18菌株攻毒,8801免疫组各脏器病理变化不明显,商品化免疫组有严重的病理变化。本实验室制备的三价灭活疫苗对血清2型QS-1和血清7型NJ-2有免疫效果,同时对血清12型AH-18也有免疫效果,可以抵御APP的感染,对于预防目前比较流行的2、7、12猪传染性胸膜肺炎具有较好的保护力。这为研制针对流行血清型的疫苗,及APP疾病的预防提供了科学参考。