非洲猪瘟（African swine fever,ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）引起的猪的急性传染病,以急性高热为特点,伴有全身及全身内脏器官出血,猪群一旦感染,发病率和死亡率均可达100%,被我国列为一类疫病,临床表现与猪瘟极其相似,极易造成误诊,我国于2018年8月3日在沈阳暴发非洲猪瘟,历经3个月已蔓延全国,其形势非常严峻。本研究对ASFV VP72基因进行原核表达及蛋白纯化,制备兔抗重组P72蛋白的多克隆抗体,并在此基础上分别建立检测ASFV抗体的间接ELISA方法和检测ASFV抗体的免疫层析试纸条。1.ASFV VP72基因的原核表达运用原核表达系统将ASFV VP72基因进行蛋白表达,优化表达条件,并进行重组蛋白纯化及抗原性鉴定。结果显示,诱导表达的重组蛋白为125 k D,鉴定其为包涵体,确立最佳诱导温度为15℃、IPTG诱导浓度为1.0 mmol/L、诱导时间为5 h,利用Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒纯化目的蛋白,测定纯化回收的蛋白浓度为1.46 mg/m L,Western Blotting鉴定结果表明,表达的重组蛋白为目的蛋白。双向琼脂扩散试验结果显示,将兔抗ASFV VP72重组蛋白的多克隆抗体浓度稀释至1:16时,肉眼依然可清楚观察到沉淀线,证明本研究纯化的重组蛋白具有良好的免疫原性与反应原性,为后续试验提供科学的基础。2.ASFV P72蛋白间接ELISA方法的建立将已纯化的P72蛋白作为包被抗原,优化包被条件,确定ELISA最佳工作条件和标准临界值,并进行特异性、重复性、符合性试验的测试。结果显示,当蛋白包被浓度为1.46 mg/m L,血清稀释倍数为1:50时,酶标仪检测的信号值最佳,酶标二抗最佳稀释倍数为1:4000,底物最佳显色时间为10 min。判定标准临界值为:当OD450nm≥0.3385,为阳性,反之为阴性。特异性试验结果显示,与标准ASFV阳性血清呈反应阳性,与其他病毒血清呈阴性,表明具有良好的特异性。重复性试验结果显示,批内与批间重复试验变异系数分别在3.15%～5.741%和2.753%～5.523%之间,表明建立的间接ELISA方法重复性良好。符合性试验结果显示,与IDVET商品试剂盒进行临床样品检测结果比对,两者的阳性符合率为86.67%（13/15）,与试验的预期目标相符。3.胶体金免疫层析检测ASFV抗体方法的建立本研究采用柠檬酸三钠还原法,将纯化后的P72蛋白标记于金标颗粒（直径30 nm）作为捕捉抗原,筛选出最佳标记蛋白量和优化胶体金p H值。分别将兔抗重组蛋白多克隆抗体标记质控线（C线）和HRP兔抗猪Ig G标记检测线（T线）固定于NC膜上,并优化C线和T线的包被浓度和最佳稀释倍数,组装试纸条,检测该试纸条的特异性、敏感性。结果显示,最佳的标记p H为7.5,最佳的标记量为30μL;T线和C线的最大划线浓度稀释倍数为1:8;胶体金试纸条性能检测结果表明制备的试纸条具有良好的特异性和重复性;当ASFV的标准阳性血清稀释到32倍时,T线依然呈现红色线条,证明制备的胶体金试纸条具有良好的灵敏性,临床样本检测结果与IDVET商品试剂盒阳性的符合率为:80%（12/15）,为临床ASFV抗体检测及疫病预防具有重要意义。