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[研究背景和目的]单肺通气(one-lungventilation,OLV)作为临床常用的机械通气模式,可引起急性肺损伤(acute lung injury,ALI)。因此,研究OLV发病机制,寻找和阐明抗OLV致肺损伤的药物及其作用机制是临床实际工作中亟待解决和研究的重点之一研究证实,花生四烯酸(arachidonic acid.AA)及其代谢产物在肺损伤的发生发展中起着重要作用。但是,它们在OLV致AL1中的作用并不十分清楚。七氟醚(Sevoflurane)为临床常用挥发性麻醉药,被发现具有抗OLV致肺损伤保护作用,但其抗OLV致肺损伤作用机制是否与影响AA及其代谢产物的生成有关,未见报道。因而,本研究旨在从AA生成和代谢关键酶途径研究OLV致ALI和七氟醚抗OLV致ALI保护作用机制,为临床防治单肺通气致肺损伤寻找药物作用的新干预途径提供一定的实验依据。[研究方法]1.实验分组1.1单肺通气致急性肺损伤动物模型的建立采用右主支气管内插管+胸骨旁开窗术,建立单肺通气致急性肺损伤动物模型。24只日本大耳白兔随机分组(n=6)为：①假手术组(S组)；②双肺通气组(T组)；③双肺通气+胸骨旁开窗术组(TF组)和④单肺通气组(O组)。1.2Clara细胞剥除动物模型的建立采用萘气吸入法建立Clara细胞剥除动物模型。随机将12只日本大耳白兔分组(n=6)为：①对照组(C组)和②萘气吸入组(NA组),连续吸入萘气(100mg/L)12h。1.3七氟醚抗单肺通气致肺损伤作用机制研究方法实验动物随机分组：①假手术组(S组)；②单肺通气组(O组)；③单肺通气+七氟醚组(OS组),OS组又按所给七氟醚浓度的不同分为1vo1%、2vo1%、3vol%和4vo1%浓度亚组：④Clara细胞剥除假手术组(NA组)；⑤Clara细胞剥除+单肺通气组(NAO组)和⑥Clara细胞剥除+单肺通气+七氟醚组(NAOS组)：每组n=6。2.各项观察指标(1)显微镜观察肺组织形态学改变,同时进行肺组织病理学评分；(2)电镜观察肺细支气管Clara细胞形态学变化并计数；(3)测定肺湿／干(wet/dry,W/D)比值；(4) ELISA测定肺组织髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)活性,肺组织花生四烯酸(AA)、前列环素(prostacyclin,Prostaglandin i2, PGI2)、血栓素A2(thromboxane A2. TXA2)及白三烯B4(leukotrienes B4. LTB4)含量；(5)计数支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)中多形核白细胞(polymorphonuclear leukocyte, PMN)数量：(6) Western-blot和定量RT-PCR分别检测肺组织Clara细胞分泌蛋白(clara cell secretory protein, CCSP)、胞质型磷脂酶A2(cytosolic phospholipase A2.C-PLA2)、环氧化酶-2(cyclooxygenase-2, COX2)和5-脂氧化酶(5-lipoxygenase,5-LOX)蛋白及其各自mRNA表达水平。[结果]第一部分动物模型的建立1.1单肺通气致急性肺损伤动物模型的建立与S组相比,O组、T组和TF组动物BALF中PMN计数,肺组织AA含量、MPO活性,肺W/D比值和肺组织病理学评分均明显增高(P<0.05)；TF组和T组动物的上述各项指标无显著性差异,但均显著低于O组(P<0.05)；光镜观察：S组动物肺组织未见明显病理学改变；T组和TF组动物肺组织可见散在充血、出血灶,肺泡腔少量红细胞和炎细胞浸润,肺泡壁略增厚；0组动物肺组织大面积充血、出血,肺泡腔内有较多红细胞和炎细胞浸润,肺泡壁广泛充血、增厚和渗出。1.2Clara细胞剥除动物模型的建立与C组相比,NA组动物肺组织CCSP mRNA和蛋白表达水平及细支气管Clara细胞计数显著降低(P<0.05),但两组间肺W/D比值和肺组织病理学评分无显著性差异。光镜观察：两组实验动物肺组织除部分区域见毛细血管扩张充血外,均未见明显病理改变。电镜观察：C组动物细支气管Clara细胞内含有较多分泌颗粒,而NA组动物细支气管内clara细胞数量明显减少且呈空泡样变性,其内未见明显分泌颗粒。第二部分七氟醚抗单肺通气致肺损伤作用机制2.1从花生四烯酸的胞质型磷脂酶A2(C-PLA2)生成途径研究2.1.1七氟醚对单肺通气致急性肺损伤兔肺组织CCSP及C-PLA2表达的影响与S组相比,O组和OS组兔肺组织CCSP mRNA和蛋白表达水平明显降低(P<0.05),肺组织C-PLA2mRNA和蛋白表达水平、AA含量、肺W/D比值及肺组织病理学评分均明显升高(P<0.05)；与O组相比,OS组动物肺组织CCSP mRNA和蛋白表达水平明显增高(P<0.05),而肺组织C-PLA2mRNA和蛋白表达水平、肺组织AA含量及病理学评分显著下降(P<0.05)；OS组不同浓度七氟醚兔肺组织CCSP mRNA和蛋白表达水平均无显著性差异,但随着七氟醚浓度的增加OS组肺组织C-PLA2mRNA和蛋白表达水平、肺组织AA含量、肺W/D比值及肺组织病理学评分逐渐降低(P<0.05)。光镜观察：S组动物肺组织除部分区域见毛细血管扩张外,无明显病理改变；O组动物肺组织可见大量出血、充血灶,肺泡腔内较多红细胞和炎症细胞浸润,肺泡壁明显充血、增厚和渗出；随七氟醚浓度增加,OS组动物肺组织上述病理形态学改变逐渐减轻。2.1.2CCSP在七氟醚抗单肺通气致急性肺损伤中的作用与S组相比,其它各组动物肺组织CCSP mRNA和蛋白表达水平均明显降低(P<0.05),肺组织C-PLA2mRNA和蛋白表达水平、AA含量、肺W/D比值和肺组织病理学评分除在NA组无显著差异外,其余各组均明显升高(P<0.05)；与NA组相比,NAO组和NAOS组肺组织CCSP mRNA和蛋白表达水平无显著差异(P>0.05),而O组和OS组明显增高(P<0.05)；与O组相比,肺组织CCSP mRNA和蛋白表达水平在OS组明显增高(P<0.05),在NAO和NAOS组明显降低(P<0.05),但肺组织C-PLA2mRNA和蛋白表达水平、肺组织AA含量、肺W/D比值及肺组织病理学评分在OS组和NAOS组中均明显降低(P<0.05),在NAO组明显增高(P<0.05)：与OS组相比,NAO组和NAOS组动物肺组织CCSP mRNA和蛋白表达水平明显降低(P<0.05),但其余各指标均明显升高(P<0.05)。与NAO组相比,NAOS组动物肺组织CCSP mRNA和蛋白表达水平无明显差异,其余各指标均明显降低(P<0.05)。光镜观察：S组和NA组动物肺组织未见明显病理形态学改变：O组动物肺组织可见大量出血、充血灶,肺泡腔内较多红细胞和炎症细胞浸润,肺泡壁明显充血、增厚和渗出；NAO组动物肺组织上述病理形态学改变进一步加重；OS组肺组织散在小范围充血、出血灶,肺泡腔内散在红细胞和炎细胞浸润,肺泡壁明显增厚、渗出；NAOS组动物肺组织病理改变与OS组类似,但明显加重。2.2从花生四烯酸的COX2和5-LOX代谢途径研究与S组相比,O组和OS组动物肺组织COX2蛋白、COX2mRNA和5-LOX蛋白、5-LOX mRNA表达水平,肺组织PGI2、LTB4和TXA2含量,肺W/D比值及肺组织病理学评分均明显升高(P<0.05),肺组织PGI2/TXA2比值明显降低(P<0.05)。与O组相比,OS组动物肺组织PGI2/TXA2比值明显升高(P<0.05),而其余指标均明显降低(P<0.05)。S组动物肺组织除部分区域见毛细血管扩张充血外,未见明显病理改变。O组肺组织可见大量出血、充血灶,肺泡腔内较多红细胞和炎症细胞浸润,可见肺泡壁明显充血、增厚和渗出；OS组肺组织散在小范围充血、出血灶,肺泡腔内散在红细胞和炎细胞浸润,肺泡壁增厚。结论1.右主支气管内插管联合胸骨旁开窗术可用于构建兔单肺通气致急性肺损伤动物模型。2.单肺通气可诱发急性肺损伤,其机制可能与下调肺组织CCSP mRNA和蛋白表达,从而削弱了其对C-PLA2的抑制作用,以及激活AA代谢COX2和5-LOX途径,使得AA及其代谢产物大量生成有关。3.七氟醚抗单肺通气致急性肺损伤作用可能与通过或不通过促进肺组织CCSP的表达而抑制肺内AA生成的C-PLA2途径,减少肺组织AA的生成有关。4.七氟醚可通过调控肺内AA的COX2和5-LOX代谢途径发挥抗单肺通气致ALI作用,其机制可能与下调COX2和5-LOX表达,减少AA代谢产物的生成和调控PGI2/TXA2比值有关。5.肺内花生四烯酸生成和代谢途径可能是七氟醚抗单肺通气致急性肺损伤作用新的潜在干预途径。