论文部分内容阅读
大量研究证明,多聚物-1(Copolymer-1, Cop-1)可启动机体的保护性自身免疫反应,对中枢神经系统和视神经具有保护作用。在青光眼模型中,Cop-1可启动T细胞介导的保护性自身免疫反应,对青光眼造成的视神经损伤具有保护作用。但是保护性自身免疫反应比较复杂,T细胞的活化可能仅仅是反应的第一步。我们借鉴中枢神经系统中Cop-1反应性T细胞可以进一步激活小胶质细胞,发挥神经保护作用的机制,推测青光眼模型中T细胞活化后也也可以进一步活化视网膜中的小胶质细胞,发挥视神经保护效用。本实验通过将Cop-1免疫于青光眼模型大鼠诱导自身免疫反应,观察视网膜中小胶质／巨噬细胞的表达和活化,分析Cop-1反应性T细胞(Tcop-1)、RGCs存活与小胶细胞相互关系,并初步探索小胶质细胞发挥作用的可能机制。我们发现：Cop-1免疫后可引起青光眼模型大鼠视网膜中小胶质／巨噬细胞的聚集和活化,活化的小胶质／巨噬细胞对RGCs具有保护作用。Tcop-1参与了小胶质细胞的活化,而非Cop-1本身直接作用。活化的小胶质细胞可以分泌一系列细胞因子TNF-α、BDNF、IL-10,可能是小胶质细胞发挥视神经保护作用的机制之一。第一部分Cop-1免疫正常大鼠视网膜中小胶质／巨噬细胞及RGCs存活的变化目的：观察并研究多聚物-1(Cop-1)免疫的正常大鼠视网膜中小胶质／巨噬细胞的形态学和数量变化以及RGCs存活的情况。方法：随机对照实验。48只正常眼压雌性Wistar大鼠,随机分为两组,分别为：24只给予Cop-1免疫(Cop-1组),24只给予PBS免疫(PBS组)。另取4只正常Wistar大鼠不予任何处理,作为空白对照组。后肢足垫给予Cop-1或者PBS免疫。分别于免疫后3d、7d、10d、17d、24d、31d,制作视网膜冰冻切片,免疫组化法观察视网膜中小胶质／巨噬细胞的形态和分布,并进行细胞计数。分别于免疫后3d、10d、24d、31d,通过荧光金上丘注射的方法逆标视网膜中的RGCs,7d后制作视网膜铺片,显微镜下观察RGCs存活情况,并进行细胞计数。统计采用随机区组设计t检验或近似t检验。结果：免疫组化结果显示：两组均存在小胶质／巨噬细胞的活化,但较PBS组,Cop-1免疫组有更多的小胶质细胞被活化,在3d、7d、10d、17d、24d小胶质/巨噬细胞计数分别为43.14+9.27/mm2,34.35+4.35/mm2,38.25+9.53/mm2,23.11±5.16/mm2和24.94+3.82/mm2,较对照组有统计学差异(各组P<0.05)。RGCs逆标结果显示：在观察的各个时间点,Cop-1免疫组的平均RGCs存活数量均较PBS组增多,在24d的时候Cop-1免疫组RGCs存活数量为2583.61±339.70/mm2,较PBS组具有统计学差异(P=0.0198)。结论：Cop-1免疫正常大鼠后视网膜中存在小胶质／巨噬细胞的聚集和活化,同时存在视网膜中RGCs凋亡速度减慢,提示Cop-1对正常大鼠RGCs存活存在保护作用。第二部分Cop-1免疫高眼压大鼠视网膜中小胶质／巨噬细胞的变化目的：观察并研究多聚物-1(Cop-1)免疫的青光眼模型大鼠视网膜中小胶质／巨噬细胞的形态学和数量变化,分析小胶质／巨噬细胞数量和RGCs存活数量的关系,明确小胶质／巨噬细胞与RGCs存活的相关性。方法：随机对照实验。64只成功建立青光眼模型的雌性Wistar大鼠,随机分为两组,分别为：32只给予Cop-1免疫(Cop-1组),32只给予PBS免疫(PBS组)。另取4只正常Wistar大鼠不予任何处理,作为空白对照组。后肢足垫给予Cop-1或者PBS免疫。分别于免疫后3d、7d、10d、17d、24d、31d,制作视网膜冰冻切片,免疫组化法观察视网膜中小胶质／巨噬细胞的形态和分布,并进行细胞计数。根据免疫组织化学结果用免疫蛋白印记法检测不同组别大鼠视网膜中MHC-Ⅱ蛋白的表达。统计采用随机区组设计t检验或近似t检验。将Cop-1组各个观察点的小胶质／巨噬细胞平均数量和对应时间点的视网膜中RGCs平均数量进行Spearman相关性回归分析。结果：免疫组化结果显示：小胶／巨噬细胞在正常视网膜上为星状、圆形,没有进程变化；而小胶／巨噬细胞在大鼠青光眼模型视网膜上为阿米巴状、柱状,随时间推移有明显进程变化。视网膜中小胶质／巨噬细胞数量增加,在两组均于第7天达到高峰,分别为105.28±7.87/mm2和82.14+3.47/mm2。Cop-1组小胶质／巨噬细胞在免疫后第7天、第10天数量远大于PBS组7天、10天细胞数量(P<0.05),此后随时间推移小胶／巨噬细胞逐渐减少,两组间无统计学差异。Western-blot结果再次证明Cop-1组小胶／巨噬细胞的活化。Spearman相关性分析显示：Cop-1组视网膜中小胶质／巨噬细胞数量与RGCs的存活数量存在正相关(coefficient=1.0, P<0.001).结论：Cop-1免疫后可引起青光眼模型大鼠视网膜中小胶质／巨噬细胞的聚集和活化,活化的小胶质／巨噬细胞数量与RGCs存活数量成正相关。第三部分Cop-1活化的T细胞对视网膜来源的小胶质细胞的活化目的：观察并研究Cop-1反应性T细胞(Tcop-1)对视网膜来源的小胶质细胞的作用,推测Tcop-1与小胶质细胞的关系,并初步探索小胶质细胞发挥视神经保护作用可能的免疫学机制。方法：通过被Cop-1免疫后的Wistar大鼠的淋巴结取材Cop-1反应性T细胞(Tcop-1)。出生后2-3d的Wistar新生鼠,分离培养视网膜来源的小胶质细胞。将Tcop-1与小胶质细胞共培养(Tcop-1+MG),观察小胶质细胞的形态学和数量变化。于培养后12h,ELISA法检测上清培养液中TNF-α、BDNF、IL-10分泌量。设置单纯T细胞和小胶细胞共培养组(Tcell+MG)、Cop-1与小胶质细胞培养组(Cop-1+MG)及Tcop-1组为对照组。统计采用单因素方差分析和Boffironni法进行分析。结果：Tcop-1与视网膜来源的小胶质细胞共培养后,观察到大量的小胶质细胞被活化,表现为数量上增多和形态学上变为阿米巴形态,而Tcell+MG组、Cop-1+MG组仅见极少量小胶质细胞被活化。ELISA结果显示：共培养12h后,Tcop-1与视网膜来源的小胶质细胞共培养组分泌的细胞因子TNF-α、BDNF、IL-10明显增多(分别为50.16±9.60pg/ml,437.42±5.01pg/ml,67.12±10.06pg/ml),较对照组有统计学差异(P<0.001, P<0.05, P<0.05)。结论：体外实验进一步证明Cop-1可活化视网膜来源的小胶质细胞,而Tcop-1参与了小胶质细胞的活化,而非Cop-1本身直接作用。活化的小胶质细胞可以分泌一系列细胞因子TNF-α、BDNF、IL-10,可能是小胶质细胞发挥视神经保护作用的机制之一。