【摘 要】
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该研究采用PCR克隆技术,克隆了来自于黑曲霉F27的植酸酶基因phyA,并在甲醇酵母Pichia Pastoris GS115中获得了功能性表达.初步筛选了6株植酸酶工程菌.选择耐受G418最高的1株G
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该研究采用PCR克隆技术,克隆了来自于黑曲霉F27的植酸酶基因phyA,并在甲醇酵母Pichia Pastoris GS115中获得了功能性表达.初步筛选了6株植酸酶工程菌.选择耐受G418最高的1株GS115-phyAF150706在摇瓶中实验探导了该重组菌的发酵规律.首先设计引物,为了能正确连接入表达载体pPIC9K和提高连接效率,在两端加上EcoRI酶切位点,在phyA基因的第二个内含子设计引物.抽提黑曲霉F27的总DNA,优化PCR反应条件后,获得特异性高产量PCR产物,连接入pBlusSCRIPTⅡ KS(+)克隆载体,获得KS-phyAF15阳性克隆,经初步验证后测序,同源性分析表明来自于黑曲霉F27的植酸酶基因和已经克隆的黑曲霉植酸酶（gi:2392）有96﹪的同源性.将获得的植酸酶基因从KS-phyAF15上用EcoRI切下回收,将回收片段连接入表达载体pPIC9K,EcoRI酶切验证后,采用α-Factor primer为5’端引物PCR筛选正向连接入pPIC9K的阳性克隆子,筛选获得pPIC9K-phyAF1507.测序结果表明,phyA基因已经以正确的方向、正确的读框,插入表达载体pPIC9K的EcoRI酶切位点中.功能验证表明,该菌表达了具有植酸酶活力的蛋白,SDS-PAGE检测到该表达的蛋白分子量约为66kDa.甲醇利用表型和对G418的抗性的实验表明,6株工程菌都为甲醇慢速利用型菌株并发现GS115-phyAE150706能够耐受1.5mg/mL的G418.在摇瓶的条件下摸索该菌株的发酵规律.植酸酶活力提高到892U/mL,为出发菌株黑曲霉F27最好的发酵条件下高约23倍.
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