支气管败血波氏菌（Bordetella bronchiseptica,Bb）是一种能感染多种哺乳动物、引起鼻炎和肺炎的革兰氏阴性细小杆菌,以犬、猪及兔的感染最为普遍,导致犬传染性支气管炎、猪传染性萎缩性鼻炎和兔支气管败血波氏菌病,也有Bb感染人的病例报道。兔支气管败血波氏菌病是由Bb引起的以鼻炎和肺炎为特征的一种家兔常见的传染病。本病主要通过呼吸道传播,分为鼻炎型、支气管肺炎型和败血型。Bb还可以与其他病原菌协同感染家兔,对群体造成严重影响。鉴于支气管败血波氏菌对兔产业的巨大危害,迫切需要开发一种新的安全、有效的兔支气管败血波氏菌亚单位疫苗来预防和控制兔支气管败血波氏菌的感染。本研究在大肠杆菌中表达了 10个支气管败血波氏菌毒力因子 SodB、IRP1-3、AfuA、Vag8、FimD、Fim3、Fim2、T3SS、SphB1、BcfA,鉴定了表达蛋白的特异性,并对这些蛋白的免疫原性进行了研究,最终筛选到具有良好免疫保护作用的BcfA蛋白,为未来兔支气管败血波氏菌病基因工程亚单位疫苗的研究奠定基础。具体研究如下:1、兔支气管败血波氏菌毒力因子的表达及鉴定本研究参照GenBank公布的支气管败血波氏菌（NCTC8344）全长基因序列,针对十个潜在的支气管败血波氏菌毒力因子SodB、IRP1-3、AfuA、Vag8、FimD、Fim3、Fim2、T3SS、SphB1、BcffA,设计了 10对特异性扩增引物。PCR扩增产物胶回收后,与pET-28a载体进行连接,经特异性引物PCR鉴定,测序正确后,将构建的原核表达载体质粒转化E.coli BL21（DE3）后诱导表达蛋白,经过SDS-PAGE电泳分析,SodB、IRP1-3、BcfA三种蛋白以可溶形式在上清中表达,AfuA、T3SS两种蛋白在上清和包涵体中都有表达,FimD、Fim3、Fim2、Vag8、SphB1主要以包涵体形式表达。Western blot显示,重组蛋白SodB、IRP1-3、AfuA、T3SS、BcfA能被兔Bb特异性阳性血清识别,表明这些蛋白有望成为疫苗候选抗原。2、兔支气管败血波氏菌主要抗原免疫保护作用初步研究以对数生长末期的兔支气管败血波氏菌在小鼠上初步建立了滴鼻攻毒模型,规定了该模型的基本标准;用表达的蛋白免疫小鼠,以建立的攻毒模型标准进行攻毒,同时检测免疫小鼠的抗体水平及其抑菌作用,最终综合评估所筛选的蛋白的免疫原性。首先,挑取支气管败血波氏菌单菌落于5 mLTSB培养基中培养,从第15 h～24 h,每小时取菌液样品用平板计数法进行计数,绘制细菌生长曲线,结果显示,支气管败血波氏菌对数生长末期约在培养20h左右。其次,以1.19×109 CFU～8.94×106CFU（50μL～10μL）不同剂量的Bb通过鼻腔滴鼻进行攻毒,取7d后未死亡小鼠肺脏进行计数,以建立Bb小鼠鼻腔滴鼻攻毒模型,结果显示,以4.17× 107 CFU（体积为35 μL）剂量攻毒的小鼠,在7d内不死亡,并可从小鼠肺部分离出相应的Bb,并以此为攻毒的标准。最后,以能被兔Bb特异性阳性血清识别的并于上清中表达的五个蛋白SodB、IRP1-3、AfuA、T3SS和BcfA免疫小鼠,10只/组,另设10只小鼠为对照组;初次免疫14d后,以同样的剂量再次免疫,10d后,以4.17×107CFU（35μL）剂量、通过鼻腔滴鼻方式进行攻毒,7 d后,取肺脏进行细菌计数:二次免疫后7d,采血清,进行抗体检测。结果显示,五个蛋白组均可以刺激小鼠产生一定水平的特异性抗体;相对于其他蛋白组,从BcfA免疫组小鼠肺脏分离到的细菌最少,保护性相对较好,可作为未来支气管败血波氏菌基因工程亚单位疫苗的候选抗原。