研究背景及目的急性心肌梗死等缺血性心脏病是世界范围内致死率最高的疾病之一。发病时,冠状动脉循环障碍引发心脏的局部缺血,导致心肌细胞数量急剧减少,严重时会使心功能失调进而导致心力衰竭。所以,增加心肌细胞数量是治疗缺血性心脏病的关键。干细胞移植是心肌再生治疗的有效途径。过去的研究致力于诱导胚胎干细胞或间充质干细胞向心肌细胞的分化,但是由于移植率和分化能力极低,治疗效果不理想,并且还存在着伦理性问题和免疫排斥问题。然而,最近研究发现在心脏内存在着一类专能干细胞,打破了长久认为的“心脏是静止的终末端分化器官”的观念。这类干细胞具有进行分裂和分化的潜能,被称作心脏干细胞(CSCs)。CSCs会在细胞表面表达不同的干细胞抗原,如：c-kit,sca-1和MDR1等。根据细胞表面抗原的种类以及细胞特性,CSCs可以分为多种类型：sca-1~+ CSCs, c-kit+ CSCs,SP细胞以及Isl1+ CSCs和心脏外植体组织块形成的干细胞簇(CDCs).这些干细胞都可以分化为心脏谱系的三种细胞：心肌细胞,血管内皮细胞和血管平滑肌细胞。但是由于SP细胞生长周期长,不利于体外研究；c-kit+细胞提取分离后培养困难；Isll+细胞只存在于胚胎期或出生后的年幼心脏中,获取材料不易以及CDCs所包含的干细胞种类不纯一等特点,都不太适合用于体外分化研究。而sca-1~+ CSCs在心脏中含量较高,容易通过磁珠分选的技术提取,后期培养也比较容易,并且sca-1基因在心脏保护中起重要作用。因此本研究选取sca-1~+ CSCs作为研究材料。鞘氨醇磷酸胆碱(SPC)是血清中的一种具有生物活性的鞘磷脂。它来源于脂类代谢,是高密度脂蛋白(HDL)的组成成分。作为内源性脂类物质,SPC对细胞的毒性更低；更容易穿透细胞膜发挥作用。目前对SPC的研究主要集中在肿瘤细胞的增殖迁移及血管平滑肌细胞的异常收缩。本实验室对SPC在心血管细胞凋亡中的作用进行了研究,发现SPC可以通过自噬保护血管内皮和心肌细胞的凋亡。目前对SPC在细胞分化中的作用研究较少。已有研究表明SPC通过激活Rho激酶促进间充质干细胞向血管平滑肌细胞的分化,但是对于CSCs向心肌细胞分化的作用尚未可知。针对以上问题,本论文研究了SPC诱导sca-1~+ CSCs向心肌细胞分化的作用及其分子机制。我们的研究为诱导心脏干细胞分化提供了一个低毒易吸收的工具,相关分子机制的研究为治疗缺血性心脏疾病提供了新的治疗靶点。研究结果1.成功提取成年小鼠的内源性sca-1~+心脏干细胞我们首先运用磁珠分选技术提取了成年小鼠的sca-1~+ CSCs。利用流式细胞术对培养第1代和第5代的细胞进行纯度分析,发现sca-1的纯度达到90%左右。用倒置显微镜观察SPC处理的sca-1~+ CSCs发现SPC处理2-3周使细胞拉长。2.SPC促进小鼠内源性sca-1~+心脏干细胞分化为心肌细胞我们用1-5μM的SPC处理CSC细胞2-6周。运用qPCR检测心脏转录因子,转录增强子和心肌标志蛋白在SPC处理后的CSCs中mRNA水平的变化。结果表明5μM SPC处理2-3周可以促进上述因子的转录。免疫荧光技术同样可以检测出5μM SPC处理3周促进心肌分化标志物cTnt的表达以及转录因子GATA4的核位移。因此,SPC能诱导CSC向心肌细胞分化。EdU实验结果表明SPC能够降低CSCs的增殖率但并不影响成熟的心肌细胞的增殖,因此,上述指标的上调并非由于增殖引起。3.JNK信号参与SPC诱导的心肌细胞分化过程中由于JNK参与了心肌分化过程,而且JNK在SPC保护的心肌细胞凋亡中起重要作用,所以我们检测了JNK信号是否参与SPC诱导的分化。Western结果表明SPC可以在1周,2周时上调JNK的磷酸化。qPCR以及免疫荧光实验结果表明, JNK抑制剂可以逆转SPC诱导的心肌细胞marker的上调。表明JNK参与了SPC诱导的CSCs向心肌细胞分化过程。4.SPC通过JNK/STAT3信号通路诱导sca-1~+心脏干细胞向心肌细胞分化有研究报道STAT3可能参与JNK调节的信号通路。我们的western实验结果表明,SPC处理1到2周可以上调STAT3 727位点的丝氨酸和705位点的酪氨酸的磷酸化,并且促进了STAT3的入核。STAT3的抑制剂Stattic,可以逆转SPC诱导的心肌细胞marker的mRNA和蛋白水平的上调。所以SPC可以通过STAT3来调节分化。我们进一步验证了JNK和STAT3之间的上下游关系,发现JNK抑制剂SP600125可以抑制STAT3的磷酸化,但是STAT3的抑制剂stattic并不能影响JNK的磷酸化,说明STAT3是JNK的一个下游靶点。因此,SPC可以通过调节JNK/STAT3信号通路来诱导心肌分化。5.SPC通过GSK3β调节β-catenin信号通路诱导Sca-1+心脏干细胞向心肌细胞的分化Wnt/β-catenin信号通路是分化过程中的经典通路。我们western检测GSK3β和P-catenin的变化,发现SPC处理1小时会促进GSK3β磷酸化短暂升高,在1周和2周时引起磷酸化降低,GSK3β的增加,该过程伴随P-catenin磷酸化升高,及总量降低。GSK3β的抑制剂LiCl和SB216763均能逆转SPC诱导的心肌细胞分化,并且调控β-catenin。β-catenin的抑制剂XAV939会进一步促进SPC诱导的心肌细胞marker的表达。因此,SPC可以通过调节GSK3β/β-catenin信号通路来诱导心肌分化。6. JNK/STAT3信号通路与β-catenin信号通路之间无交叉为了研究JNK/STAT3信号通路与β-catenin信号通路之间是否有交叉,我们利用一系列的抑制剂,western检测发现SP600125和stattic并不能影响GSK3β和β-catenin,而且GSK3β的抑制剂也不会影响JNK/STAT3。表明这两条通路是独立的。7.脂筏有可能作为一个激活JNK/STAT3信号通路的调节子存在脂筏是细胞膜上富含胆固醇的微小区域。我们之前的研究报道SPC可以通过脂筏来调控心肌细胞的自噬与凋亡。我们用β-环糊精破坏了脂筏可以消除SPC对JNK/STAT3的激活,但是对SPC抑制的β-catenin没有影响。并且我们实验结果显示,早期分化中SPC降低了脂筏相关蛋白ROCK1的表达,因此SPC可能是通过作用于脂筏进而通过影响ROCKs调节JNK/STAT3信号通路。