第一部分乳腺癌细胞膜仿生造影剂的制备及性能检测目的制备新型乳腺癌细胞膜仿生造影剂(MPFTNPs),检测材料表征、光热性能、光动力性能;细胞实验检测其特异性靶向同源肿瘤细胞的能力、光热性能及活性氧产生能力。方法采用溶质交换法制备包裹原卟啉IX(Protoporphyrin IX,PpIX)的单宁酸(tannic acid,TA)与铁离子络合物,即PpIX@Fe~ⅢTA(PFTNPs)。通过声震法在其表面修饰乳腺癌的细胞膜,制成乳腺癌细胞膜仿生造影剂CCCM-PpIX@Fe~ⅢTA(MPFTNPs),并检测其形貌特征(透射电子显微镜及扫描电子显微镜)、粒径电位特征、PpIX包封率、紫外吸收光谱、细胞膜蛋白等材料表征,检测MPFTNPs在808 nm激光仪激发下在不同pH环境下的光热特征。通过660 nm激光仪辐照检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生。流式细胞术法及激光共聚焦显微镜法分别观察MPFTNPs被不同肿瘤细胞(包括MDA-MB-231细胞,PANC-1细胞和HepG2细胞)的吞噬情况。结果采用超声声震法及溶质交换法成功制备了MPFTNPs乳腺癌细胞膜仿生造影剂,透射电子显微镜(Transmission electron microscope,TEM)可见MPFTNPs粒径分布均一,呈现清晰的壳核结构。扫描电子显微镜(Scanning electron microscope,SEM)可见MPFTNPs分散性良好,形态呈规则球形。马尔文粒径仪测得MPFTNPs粒径为295.3 nm(PDI:0.311),电位为-15.4 mV。紫外吸收光谱显示MPFTNPs保留了PpIX的吸收峰,并测得其包封率为91%。SDS-PAGE结果显示MPFTNPs保留了细胞膜表面膜蛋白。体外光热实验显示MPFTNPs具有较高的光热转换效率,且细胞膜修饰后可提高裸MPFTNPs在酸性条件下的光热效果。细胞内光动力实验表明MPFTNPs可在660nm激光仪辐照下产生活性氧。在同源性肿瘤细胞中吞噬最明显。结论通过溶质交换法及声震法成功制备了MPFTNPs造影剂,该造影剂粒径分布均一,形态规整,呈球形,PpIX包封率高,保留了肿瘤细胞表面的膜蛋白。MPFTNPs可分别在660 nm激光仪辐照下产生活性氧,808 nm激光仪激发下产生热效应,且细胞膜修饰后可提高裸MPFTNPs在酸性条件下的光热效果,可高效靶向同源肿瘤细胞。这些特征为进一步评估其在细胞水平光热及光动力治疗效能提供依据。第二部分乳腺癌细胞膜仿生造影剂光声/MRI双模态成像研究目的观察MPFTNPs作为双模态造影剂体外光声成像及MRI成像效果;建立小鼠乳腺癌皮下移植瘤模型,分别观察MPFTNPs在体内光声成像及MRI成像效果,从而评价其体内外双模态成像能力。方法利用50孔离心管盒建立磁共振成像模型,应用磁共振成像系统对不同浓度MPFTNPs进行磁共振成像并分析相应的信号强度。建立凝胶模型对不同浓度MPFTNPs进行光声成像检测并分析相应的信号强度。在裸鼠皮下注射MDA-MB-231细胞,建立皮下移植瘤模型并进行体内光声/MRI双模态成像实验。经裸鼠尾静脉注射MPFTNPs后不同时间点(0,2,6和24小时)分别进行光声成像、T1加权磁共振成像,检测每个时间点的信号强度。结果体外成像结果显示,MPFTNPs双模态成像造影剂可实现光声及T1加权磁共振成像,且光声信号与T1加权MRI成像信号均与MPFTNPs浓度呈正相关。荷瘤裸鼠经尾静脉注射MPFTNPs后,肿瘤部位T1加权磁共振、光声信号逐渐增强,在24小时达到最高峰。结论制备的MPFTNPs纳米探针在体外模型中具备良好的光声及T1加权磁共振成像性能。荷瘤裸鼠实验表明MPFTNPs可在肿瘤部位有效富集并显示出光声成像及MRI双模态成像效能,在乳腺癌双模态成像及光治疗领域有广阔的应用前景。第三部分乳腺癌细胞膜仿生造影剂光治疗的实验研究目的研究MPFTNPs光热及光动力治疗乳腺癌的效果,在体内外分别评估MPFTNPs的生物安全性及协同治疗乳腺癌的能力。方法CCK-8法评估MPFTNPs纳米粒对MDA-MB-231细胞的杀伤作用及生物相容性。808 nm激光辐照下,分别评价PFTNPs和MPFTNPs对MDA-MB-231肿瘤细胞的光热杀伤作用。CCK-8法、流式细胞术及激光共聚焦显微镜评估光热和光动力效应对乳腺癌MDA-MB-231细胞的联合杀伤作用。建立MDA-MB-231移植瘤模型,当肿瘤体积生长至60-70 mm3后,将荷瘤裸鼠随机分为6组:(1)对照组;(2)单纯激光组;(3)单纯MPFTNPs组;(4)光动力治疗组;(5)光热治疗组;(6)光动力/光热协同治疗组。在(2)组和(6)组分别使用808 nm激光仪(2.0W/cm2,5 min)和660 nm激光仪(100 m W/cm2,30 min)辐照。在(4)组使用660 nm激光仪(100 m W/cm2,30 min)辐照。在(5)组使用808 nm激光仪(2.0 W/cm2,5 min)辐照。在尾静脉注射MPFTNPs后24小时,使用808 nm激光仪辐照肿瘤部位,使用热红外成像仪监控治疗过程中温度变化,并采集相应热成像图片,绘制温度变化曲线。各组荷瘤裸鼠在治疗后观察14天,每2天分别测量肿瘤直径及荷瘤裸鼠体重。每组荷瘤裸鼠在处理后24小时,每组荷瘤裸鼠中随机选取一只处死并取出肿瘤,H&E、PCNA和TUNEL染色后,使用光学显微镜计数肿瘤细胞增殖和凋亡,并做定量分析。为了评估MPFTNPs的生物安全性,每组荷瘤裸鼠在处理后24小时,随机选取一只处死并取出各主要器官进行H&E染色,分别观察其形态学改变。此外,经健康昆明小鼠尾静脉注射不同剂量MPFTNPs(0,10,20和40 mg/kg),在30天后收集血液做血常规及血生化分析,比较各项指标的变化情况;取出各主要器官(包括心、肝、脾、肺、肾和脑)进行H&E染色,分别观察其形态学改变。结果MPFTNPs生物相容性良好,在808 nm激光仪辐照下可通过光热效应杀灭乳腺癌MDA-MB-231细胞,在660 nm激光仪辐照下可通过光动力效应杀灭乳腺癌细胞,光热和光动力联合治疗杀伤MDA-MB-231细胞效果最强。808 nm激光辐照肿瘤后,肿瘤温度逐渐升高。体内热成像显示激光辐照后,肿瘤部位温度明显升高,可达56.1℃,达到光热治疗杀伤肿瘤细胞的温度。而PFTNPs纳米粒组在激光辐照后,温度为48.5℃,对照组温度仅为42.3℃。提示PFTNPs可作为光热治疗剂实现肿瘤的光热治疗,细胞膜的包裹可增强光热治疗乳腺癌的治疗温度,从而有利于提高治疗疗效。在光热治疗组和光动力治疗组,肿瘤体积分别增长了3.98倍和5.20倍,肿瘤生长速度慢于对照组(肿瘤体积增长10.76倍),说明光热治疗及光动力治疗均能在一定程度上抑制肿瘤生长。而在光动力与光热协同治疗组,肿瘤生长完全受到抑制。肿瘤组织H&E染色结果显示,光动力、光热及协同治疗组肿瘤细胞形态明显破坏,可见细胞核固缩、碎裂及溶解;PCNA和TUNEL染色结果可见光动力、光热及协同治疗组相对于对照组细胞增殖指数降低、凋亡指数升高,具有显著性差异(***P<0.001)。荷瘤裸鼠各主要器官的H&E染色结果未见明显病理学损伤。昆明鼠各主要器官的H&E染色结果亦未见明显病理学损伤。昆明鼠各项血常规和血生化结果与对照组相比亦未见明显异常。结论MPFTNPs可分别在660 nm激光激发下进行光动力治疗,808nm激光仪激发下进行光热治疗,光热治疗与光动力治疗联合杀灭乳腺癌细胞效果最强。细胞膜包裹后的MPFTNPs在肿瘤部位的光热表现优于无细胞膜包裹的PFTNPs,从而有利于提高治疗疗效。MPFTNPs能够通过联合光热及光动力机制完全抑制肿瘤生长。另外,在短期(1天)和相对长期(30天)内生物相容性良好,具有广阔的临床应用前景,MPFTNPs有望成为一种理想的乳腺癌细胞膜仿生治疗剂。