论文部分内容阅读
本论文主要研究不同模式日粮对奶牛乳腺中乳脂合成影响及长链脂肪酸添加对奶牛乳腺上皮细胞的乳脂合成影响机理,通过体外的长链脂肪酸添加试验研究动物试验中脂肪酸合成及长链脂肪酸的变化机理-。探讨长链脂肪酸的最佳组合对乳脂的合成影响变化,为完善乳脂的代谢模型提供依据,并为改善牛奶的品质提供理论依据。本论文主要包括四个试验：1.试验一采用完全随机区组试验设计,将30头牛随机分为三个组,每个组10头。三组的试验日粮分别是：1)混合粗饲料组(IMF),精粗比为46：54；2)高精料秸秆组(CS1),精粗比为65：35,其营养水平与IMF组相近；3)低精料秸秆组(CS2),精粗比为46：54。本试验共进行三期,每期21天,其中14天为适应期,7天为样品采集期,在试验最后一天采集乳腺组织进行乳脂合成相关基因表达影响研究。试验结果为在营养水平较低日粮(CS2)组奶牛的乳产量显著低于营养水平较高日粮组(IMF和CS1)奶牛的乳产量。乳脂,乳蛋白和总固型物含量在IMF都为最高。饱和脂肪酸和短链脂肪酸在IMF组含量最高,单不饱和脂肪酸(MUFA)和长链脂肪酸(LCFA)在CS2组最高,而多不饱和脂肪酸(PUFA)在CS1组最高。乳脂合成相关基因FASN、SCD、LPL和CD36在IMF的表达量均高于秸秆组,但脂肪酸网络调控基因没有显著影响。2.将试验一中所采集的乳腺组织进行高通量转录组测序,对奶牛乳腺组织的整体转录水平进行研究,进一步研究日粮对奶牛乳腺组织转录组中乳脂及乳蛋白差异基因表达丰度的影响。试验结果证明我们的转录本数据完全符合进一步分析的要求。在对预测基因进行COG功能分类预测,发现共有18828个Unigene被注释上25种COG分类。其中关于信号转导机制功能的最多,其中关于脂类转运和代谢功能的有877个Unigene,关于氨基酸转运和代谢功能的共有595个Unigene o在对Unigene进行GO功能分类预测,有211947个Unigene被注释上GO分类,其中共有96295个归为生物学过程(Biological Process),共有77729个归为细胞成分(Cellular Component),共有37950个归为分子功能(Molecular Function)。在KEGG对脂类代谢通路进行分析后得出,IMF组的脂肪酸生物合成通路中基因丰度值都显著高于CS组,而脂肪酸延伸和不饱和脂肪酸合成通路中基因丰度值都显著低于CS组,与乳脂含量及浓度的趋势相一致。3.由于前期动物试验中不同日粮模式对乳脂中长链脂肪酸有显著影响,为进一步研究长链脂肪酸变化对乳脂的影响机理,我们在体外以奶牛乳腺上皮细胞为模型,进行单一长链脂肪酸添加,测定乳腺上皮细胞的增殖能力,从每种脂肪酸添加浓度中筛选出不能对细胞增殖产生抑制作用的四个浓度梯度,进行三种不饱和脂肪酸(UFA)的正交试验(L16(43))和五种长链脂肪酸(LCFA)的正交试验(L16(45))。采用甘油三脂试剂盒对细胞中甘油三酯含量进行测定,确定出三种不饱和脂肪酸的最佳浓度组合为100μM油酸、100μM亚油酸和1.4μM亚麻酸,五种长链脂肪酸的最佳浓度组合为100μM棕榈酸、5μM硬脂酸、100μM油酸、25μM亚油酸和1.2μM亚麻酸。发现三种UFA中对奶牛乳腺上皮细胞甘油三酯合成影响的顺序为：C18：3>C18：2>C18：1,五种LCFA中对奶牛乳腺上皮细胞甘油三酯合成影响的顺序为：C18:0>C18:2>C18:3>C18:1>C16:0。添加长链脂肪酸对细胞中的甘油三脂含量有显著促进作用,且添加饱和长链脂肪酸后的促进效果更显著。.而对基因表达的影响结果是LCFA组的FASN表达量最低,而CD36和PPARG表达量最高；对照组的SCD和ACSL1表达量最低；UFA组的SREBF1和AGPAT6表达量最低。在细胞中LCFA组的中短链脂肪酸(SMFA)含量最低而UFA含量最高,对照组的SFA含量最高,培养基中C18：0在UFA组中显著高于LCFA组。4.将五种脂肪酸添加的最佳组合逐一回撤研究其对乳脂合成的影响。对处理组进行甘油三脂含量,细胞中乳脂合成相关基因表达量及细胞和培养基中的脂肪酸含量的测定。结果显示回撤长链脂肪酸对甘油三脂合成的影响结果与前期试验结果一致,即硬脂酸是对甘油三脂合成影响最大的长链脂肪酸。回撤试验对从头合成基因ACACA和FASN基因没有显著影响。回撤亚麻酸对细胞中FABP3、ACSL1和SREBF1有显著升高作用,回撤C16：0对LPL表达量显著提高。在细胞中SMFA在对照组中的含量最高,LCFA的含量最低。回撤C18：3n3后SFA含量最高,UFA含量最低。在培养基中回撤C16：0后LCFA含量最高。回撤C18：0后SFA含量最高,UFA含量最低。综合本试验的研究结果可以得出,营养平衡日粮可以提高泌乳奶牛乳产量、乳脂和乳蛋白含量以及一些乳脂合成相关基因的表达,从转录水平上可以验证乳脂含量及组成的结果。通过体外长链脂肪酸添加可以提高奶牛乳腺上皮细胞甘油三脂含量,降低细胞从头合成基因,提高转运基因和网络调控基因的表达,使细胞中的中短链脂肪酸含量降低,不饱和脂肪酸含量升高,硬脂酸对甘油三脂合成影响最大,五种长链脂肪酸对从头合成没有显著选择性,亚麻酸对细胞的网络调控和转运基因更敏感,棕榈酸对LPL产生显著性抑制。