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奶牛性控冷冻精液人工授精的性控繁育技术可以快速增加良种奶牛数量,提升奶牛养殖经济效益,是目前奶牛养殖产业化推广应用最成功、最有效的繁育生物技术手段。奶牛缺陷精子包括形态畸形与顶体破损、DNA缺陷、死精子三种类型。奶牛精液中的缺陷精子直接影响奶牛种公牛遗传资源利用率、性控冷冻精液生产效率及其人工受精的受胎率。本研究旨在通过特异性蛋白鉴别三种奶牛精液中的缺陷精子,然后与免疫磁珠结合在X∕Y精子性控分离前去除缺陷精子,提高奶牛性控冷冻精液生产效率及产品中的正常精子比例,促进该产品的产业化应用效果,同时为人工辅助生殖等相关方面的研究和应用提供一定的实验依据。本研究共分两部分:第一部分为畸形与顶体破损、DNA缺陷奶牛精子的鉴别及结合免疫磁珠方法的奶牛精液中缺陷精子去除技术研究。首先分析确认奶牛精子泛素化水平同精子畸形及精子DNA缺陷的相关性。实验结果显示,通过western blotting和单通道流式细胞法检测均证明奶牛精子泛素化水平同精子畸形率具有显著相关性(p<0.05);进一步通过双通道流式细胞法检测结果表明,奶牛精子泛素化水平同精子DNA缺陷水平具有显著相关性(p<0.05)。在此基础上,选择抗泛素化蛋白作为特异抗体,设计了结合免疫磁珠抗泛素化蛋白去除奶牛精液中的畸形与顶体破损、DNA缺陷精子的技术流程。实验结果表明该技术流程可以有效去除奶牛精子中的畸形和顶体破损精子(p<0.05)。结论:利用特异性抗泛素化蛋白与免疫磁珠结合,可以在X∕Y精子性控分离前明显去除奶牛精液中的畸形和顶体破损缺陷精子,提高奶牛性控冷冻精液产品质量。第二部分为奶牛死精子与膜联蛋白V(Annexin V)的特异性结合确认及免疫磁珠方法去除奶牛死精子的应用技术研究。实验研究结果表明,Annexin V可以与奶牛死精子进行特异性结合。据此选择Annexin V作为奶牛死精子的特异标记,然后设计利用免疫磁珠结合Annexin V去除奶牛精液中死精子的技术流程。实验结果显示分选后精子的活力、膜完整性、线粒体活性和X∕Y分离死精率均有不同幅度的改善,说明该技术流程设计可以有效去除部分死精子,但是对于分离后的X或Y精子制备的性控冷冻精液各项指标均没有明显影响(p>0.05)。结论:利用膜联蛋白V(Annexin V)的特异性结合免疫磁珠方法可以有效去除奶牛精液中的死精子,显著降低性控分离时的奶牛精子死精率(p<0.05),有效提高奶牛性控冷冻精液生产效率、降低了生产成本,推动了该产品的产业化应用。