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8-异戊烯基柚皮素是啤酒花中发现的一种具有雌激素作用的异戊二烯基黄酮,被认为是迄今发现最具潜力的植物雌激素。除雌激素作用外,它还具备其他一些生理活性,包括预防癌症,调节骨代谢,抑制血管增生和抗氧化等。本论文以异黄腐酚为前体,对8-异戊烯基柚皮素的生物催化合成进行了深入研究。
首先建立了生物转化体系中异黄腐酚和8-异戊烯基柚皮素的同步检测方法。检测条件为Phenomenex C18反相柱(4.6 mm×250 mm,4μm),流动相:乙腈(A)-1%甲酸溶液(B),检测温度30℃,流速0.8 mL/min,进样量10μL,检测波长288 nm,跑样时间35 min,流动相比例为0-20 min,A40%-100%;20-25 min,A保持100%;25-28 min,A100%-40%。
为了有效解决底物异黄腐酚价格昂贵的问题,本文利用高速逆流色谱技术和化学异构法构建获得了1条高纯度异黄腐酚的制备路线,所得的异黄腐酚结构经高效液相色谱(HPLC)、质谱(MS)和核磁共振(NMR)鉴定,纯度大于90%,可用于后续的生物转化研究。
通过菌种筛选得到爪哇正青霉AS3.5706(Eupenicillium javanicum)作为生物催化合成8-异戊烯基柚皮素的菌株,同时确定种子预培养3 d后的直接生长转化法G2作为最佳生物转化方式,并设计响应面对转化条件进行了优化,优化后的条件为底物添加量0.1 mg/30mL,吐温80添加量0.2%,接种量1%,葡萄糖浓度1%。在此条件下,8-异戊烯基柚皮素得率可达6.62%,与未优化前相比提高了48.6%。
对调控生物转化的关键酶进行了初步研究,建立了生物转化体系中O-脱甲基酶酶活测定方法,对生物催化合成8-异戊烯基柚皮素的过程进行了分析,利用细胞色素P450酶抑制剂间接证明参与生物转化反应的O-脱甲基酶是细胞色素P450酶系的一种。同时对生物转化体系中的O-脱甲基酶的酶学性质进行了初步研究,发现O-脱甲基酶的最适反应温度为60℃,在30-60℃之间较为稳定;最适pH为8.0,在pH3-6之间酶活较为稳定。