【摘 要】
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将糖基与不具韧皮部输导性的农药分子偶合能够使其获得韧皮部输导性,通过植株体内的转运载体介导,运输到植株目标部位,通过β-葡萄糖苷酶水解释放出活性分子,达到靶向施药的目的。β-葡萄糖苷酶能够水解非还原性的β-D-糖苷键,其参与了植物化学防御的过程,本文利用分子模拟方法研究底物与β-葡萄糖苷酶的相互作用,分析了在静态与动态情况下的差异,设计了新一系列的糖基氧苷-氟虫腈偶合物。利用生物学手段测定了体外酶
【基金项目】
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国家重点研发项目:华南及西南水稻化肥农药减施技术集成与示范（项目编号:2018YFD0200300）; 国家自然科学基金:基于植物体内黑芥子酶的硫苷导向农药靶向释放与积累 （项目编号:31672044）
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将糖基与不具韧皮部输导性的农药分子偶合能够使其获得韧皮部输导性,通过植株体内的转运载体介导,运输到植株目标部位,通过β-葡萄糖苷酶水解释放出活性分子,达到靶向施药的目的。β-葡萄糖苷酶能够水解非还原性的β-D-糖苷键,其参与了植物化学防御的过程,本文利用分子模拟方法研究底物与β-葡萄糖苷酶的相互作用,分析了在静态与动态情况下的差异,设计了新一系列的糖基氧苷-氟虫腈偶合物。利用生物学手段测定了体外酶解活性和酶动力学参数,通过蓖麻输导体系测定了其韧皮部输导性。用同源建模的方法构建了β-葡萄糖苷酶（EC 3.2.2.21）的三维结构。从NCBI数据库中获取序列参数,再利用序列搜索功能,得到4个同源度较高的晶体结构:1CBG、3PTK、3WTK、4ATD,进行多模板建模,选取最优的结构作为最终的β-葡萄糖苷酶,再利用Profile-3D进行蛋白结构的验证,最终得到可信度较高的三维结构。利用分子对接与分子动力学研究了底物与β-葡萄糖苷酶的相互作用。结果显示三个小分子均能够与活性口袋中关键氨基酸残基（GLU276和GLU512）进行识别,并产生较强的氢键作用,同时,亲和力大小:GOTF>GOF>p NPG,通过分子对接和分子动力学获取的优势构象中GOTF比GOF和p NPG更稳定。对底物-蛋白复合物进行了结合自由能的计算（MM-PBSA）。结果显示结合自由能:GOTF>GOF>p NPG,反映了小分子和蛋白的亲和力:GOTF>GOF>p NPG。同时,GOF和p NPG形成复合物的过程中E512起到最关键的作用,而GOTF形成复合物的过程中W484起到了最关键的作用,这说明了不同底物之间相互作用的特异性差异。利用拉伸分子动力学方法研究底物离去靶标位点的过程。结果显示GOTF的最大牵引力小于GOF,GOTF更易被拉出口袋,且在口袋外部多为疏水残基,在GOTF被拉出的过程中会更快地被排出,相反的,在进入口袋的过程中会更快到达活性位点;p NPG比GOTF具有更小的位阻作用,使拉伸的过程变得更加容易,相反进入活性口袋的能力也比GOTF要强,则造成水解效率:p NPG>GOTF>GOF。分析了水解机制的差异,设计合成了糖基氧苷氟虫腈偶合物,并测定了5个化合物体外酶解差异及酶代动力学参数。结果显示GOE4具有优异的酶解活性,较之前期所构建的糖基氧苷偶合物,酶解活性有显著的提升;利用Lineweaver-Burk双倒数作图法计算得到酶代动力学参数,其中GOE5的Km值最小,GOE4的比活力值以及酶催化常数最大,因此GOE5与酶的亲和力强于GOE2,GOE4最易与酶发生水解反应,GOE2最不易发生水解反应。本文利用蓖麻植株体系测定了所构建偶合物的韧皮部输导性,结果显示在2 h内GOE2的输导性最好,韧皮部渗出液药物浓度为27.84±4.34μmol/L,同时也优于GOF与GOTF。同时也研究了菜心（Brassica para chinensis Bail.）吸收的生物活性,发现糖基氧苷氟虫腈偶合物对小菜蛾（Plutella xylostella L.）均有一定的杀虫活性,最高是GOE6:46.88±3.27%。本文基于β-葡萄糖苷酶进行了作用机制的研究,设计了新系列的糖基氧苷-氟虫腈,利用β-葡萄糖苷酶参与植物的化学防御进行新农药的开发,为导向农药的分子设计提供了新思路。
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