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目的：应用分子生物学技术研究蛋白激酶C(ProteinKinaseC,PKC)存人Tenons囊成纤维细胞(HTFs)中的表达及PKCα对细胞增殖的影响；探讨PKCα在青光眼滤过术后滤过通道瘢痕形成中的信号调控作用。
方法：1、正常HTF细胞的体外培养和鉴定：取正常供体新鲜的Tenons囊组织，采用组织块培养法，进行成纤维细胞体外培养，免疫细胞化学法鉴定HTF细胞。
2、PKC亚型在HTF细胞中的表达与分布：利用激光共聚焦显微镜(Laserscanningconfocalmicroscope，LSCM)用免疫细胞荧光的方法从细胞水平检测十二种PKC亚型在HTF细胞的空间分布，用RT-PCR和Westernblot方法从基因和蛋白水平来测定这十二种PKC亚型在HTF细胞的表达情况。
3、设计、合成靶向PKCα基因的siRNAs，并进行筛选得到具有高效干扰效率的siRNA。
4、研究PKCα对HTF细胞周期相关因子的影响：利用脂质体将PKCα亚型正义重组质粒pXJ41-PKCα及siRNA-PKCα转入体外培养的HTF细胞，分别使PKCα上调、下调表达，从而研究PKCα对细胞周期相关因子表达的调控作用。
5、比较MMC和siRNA-PKCα对HTF细胞增殖的影响：将不同浓度的MMC(0.4mg/ml、0.2mg/ml、0.1mg/ml、0.05mg/ml)和siRNA-PKCα(20nM、50nM、100nM、200nM)分别作用于HTF细胞，同时设有空白对照组，然后用MTT法检测MMC作用及RNA干扰后对成纤维细胞增殖能力的影响，绘制其量效曲线；并检测siRNA-PKCα转染后部分细胞因子的改变。
结果：1、体外成功培养正常HTF细胞，细胞呈长梭形，胞浆丰富，核大，生长能力强，呈旋涡状或羽毛样生长，Vimentin、FN胞浆染色阳性，角蛋白染色阴性。
2、发现HTF细胞中12种PKC亚型在细胞、蛋白及基因3种不同水平上均有基本相似的表达结果。LSCM、RT-PCR、Westernblot发现在HTF细胞中有PKCα，PKCδ，PKCε，PKCη，PKC1，PKCλ，PKCζ,和PKCμ等8种亚型的分布，未见PKCβⅠ，PKCβⅡ，PKCγ,PKCθ的表达；免疫细胞荧光方法同时可以看到表达蛋白在细胞中主要分布于胞浆部分。
3、设计合成的siRNA经筛选获得1条较为高效的siRNA；体外培养的成纤维细胞经RNA干扰后24小时，RT-PCR检测显示：PKCα的mRNA受到了明显抑制。
4、RT-PCR检测结果示：分别上调、下调PKCα的表达，发现CDK1、CDK2、cyclinB2、cyclinD1、cyclinD3、cyclinE1、p21、p19、p18、Rb等细胞周期相关因子mRNA水平发生了改变。
5、MTT法结果显示：MMC和siRNA-PKCα作用于体外培养的HTF细胞后对细胞的增殖均有明显抑制作用。MMC浓度为0.05mg/ml、0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml时的抑制率分别为47.98％、59.81％、79.75％、85.05％，靶向RNA干扰抑制PKCα的转染浓度为20nM、50nM、100nM、200nM时的抑制率分别为4.21％、14.47％、39.19％、41.03％。但MMC作用于HTF细胞后，细胞形态发生改变，完整性受到破坏，细胞碎片增多，而siRNA-PKCα作用于HTF细胞后，细胞形态较完整，未见明显破坏。
6、RT-PCR检测结果示：靶向RNA干扰抑制PKCα后，MMP2、MMP3、TGFβ1、TGFβ2以及CTGF的表达均受到抑制。
结论：1、PKC呈亚型特异性分布及独特的亚细胞定位。HTF细胞中有PKCα，PKCδPKCε，PKCη，PKCζ，PKC1，PKCλ和PKCμ等8种亚型的分布，未见PKCβⅠ，PKCβⅡ，PKCγ,PKCθ的表达；免疫细胞荧光方法同时可以看到表达蛋白在细胞中主要分布于胞浆部分，PKCδ在胞浆中则呈细胞骨架样分布。
2、分别上调、下调PKCα的表达，发现CDK1、CDK2、cyclinB2、cyclinD1、cyclinD3、cyclinE1、p21、p19、p18、Rb等细胞周期相关因子发生了相应改变。我们认为PKCα对HTF细胞增殖的信号调控作用最终是通过对细胞周期相关因子的调控实现的。
3、siRNA-PKCα和MMC在一定程度上均可抑制HTF细胞的增殖。MMC抑制效率较高，但是细胞形态发生较大改变；100nM的siRNA-PKCα可以产生有效的抑制效率，并且细胞形态基本完整，不会对周围正常细胞产生较大毒性。同时发现，随着siRNA-PKCα的转染浓度的升高抑制程度增加，当siRNA的转染浓度为100nM时，抑制效率的变化不再明显。
4、siRNA-PKCα在滤过区瘢痕化中的信号调控作用除了通过细胞周期相关因子调节HTF细胞周期进程影响细胞增殖外，还可以抑制MMP2、MMP3、TGFβ1、TGFβ2、CTGF的表达分泌，可能在抑制HTF细胞的增殖移行、胶原的合成以及新生血管的生成过程中发挥一定作用。