【摘 要】
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多年生黑麦草（Lolium perenne L.）属禾本科黑麦草属植物,重要的优质冷季型草坪草和牧草,具有生长速率快,营养价值高,产草量高,耐贫瘠,耐粗放管理等特征。我国盐碱土壤面积较广,然而多年生黑麦草耐盐碱能力处于中等水平,因此其推广应用受到极大限制。本研究以多年生黑麦草为研究对象,同时基于前期RNA-Seq数据,从多年生黑麦草中克隆出一个受盐胁迫显著诱导的MATE家族基因LpMATE1基因,
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多年生黑麦草（Lolium perenne L.）属禾本科黑麦草属植物,重要的优质冷季型草坪草和牧草,具有生长速率快,营养价值高,产草量高,耐贫瘠,耐粗放管理等特征。我国盐碱土壤面积较广,然而多年生黑麦草耐盐碱能力处于中等水平,因此其推广应用受到极大限制。本研究以多年生黑麦草为研究对象,同时基于前期RNA-Seq数据,从多年生黑麦草中克隆出一个受盐胁迫显著诱导的MATE家族基因LpMATE1基因,并对该基因进行系统的功能验证。本研究结果对建立和完善黑麦草遗传转化体系以及研究LpMATE1基因在植物抗盐胁迫中的功能和培育黑麦草耐盐新品种具有重要意义。主要研究结果如下:1.利用RNA-Seq技术挖掘了多年生黑麦草中受盐胁迫显著诱导的LpMATE1基因并进行基因克隆。该基因开放阅读框为1650 bp,编码一条含有549个氨基酸的多肽链。经过生物信息学预测该基因编码位于细胞膜上稳定性较高的一类疏水性跨膜蛋白。对该基因和其他物种MATE家族基因进行同源性分析发现其与水稻OsMATE34基因同源性较高。2.构建黑麦草LpMATE1基因的亚细胞定位融合表达载体pBI121-eGFP:LpMATE1,农杆菌介导瞬时转化烟草,通过激光扫描共聚焦显微镜观察该融合蛋白定位在细胞膜上。3.为初步验证LpMATE1基因在植物耐盐方面的功能,在拟南芥中构建过表达载体pRI101-AN35S:LpMATE1,通过农杆菌介导浸花法侵染拟南芥进行遗传转化,经过卡那（kan）抗性筛选和PCR阳性植株鉴定获得T3代拟南芥LpMATE1超表达阳性转化株。对转基因拟南芥进行耐盐表型验证,结果显示在NaCl处理下,转基因拟南芥的发芽率、根长及鲜重显著高于野生型。4.为进一步验证LpMATE1基因在黑麦草耐盐方面的功能,同时构建超表达载体PANIC-6B:LpMATE1,通过农杆菌介导法侵染黑麦草愈伤组织并培养至放分化生根,经过GUS染色和PCR鉴定获得黑麦草LpMATE1超表达阳性植株。对转基因黑麦草进行耐盐表型验证,结果显示在400 mM NaCl胁迫下,转基因黑麦草的萎蔫程度较野生型更轻,相对生长速率、相对生长量、相对电导率以及POD活性都优于野生型,光合色素降低比率也低于野生型。综合上述研究结果,多年生黑麦草LpMATE1基因对提高黑麦草耐盐性具有重要作用。本研究为黑麦草耐盐育种提供了重要的理论依据。
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