党参根腐病生防菌的促生防病效果及机理研究

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党参(Codonopsis pilosula)为桔梗科草本植物,是一种常用的中药材。近几年以来,党参根腐病在临洮县、渭源县、陇西县发病严重,对党参的品质及产量造成巨大的影响。党参根腐病的防治主要为轮作和化学杀菌剂防治,但其防治效果甚微。为此采用生防菌对党参根腐病的防治成为一种新的手段。本研究通过分离得到的党参根腐病病原菌和生防菌为研究对象,开展了生防菌的防治效果和防治机理研究。本论文研究结果如下:1、从甘肃省渭源县采集党参根腐病样品,通过对病原菌分离并鉴定,最终确定尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)为党参根腐病病原菌。并在羊粪堆肥中分离出对党参根腐病病原菌具有较强抑制作用的菌株YF,通过对菌株YF基因分析,证实YF为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)。2、通过对生防菌YF培养基的优化,确定最优的碳源、氮源、无机盐分别为蔗糖、蛋白胨、硫酸镁,并采用正交试验的方法最终确定YF的最适培养基为:氯化钠3g,蔗糖15g,硫酸镁5g,蛋白胨15g,水1L。优化后,将生防菌YF的发酵液(无菌)加入培养基,使尖孢镰刀菌菌丝生长明显受到抑制;10%的生防菌YF发酵滤液处理组孢子萌发率仅为14%。盆栽试验结果表明生防菌YF防效为89.2%,多菌灵防效为66.5%。并测定了生防菌YF的治疗效果和预防效果,结果显示预防处理的防治效果为100%,治疗处理的防治效果为83%。通过植物生长激素检测证明生防菌YF分泌IAA,并且在施加生防菌YF后党参的株高、根长、根鲜重、根干重均高于空白对照组。为了进一步确定生防菌YF在党参上的防效和促生效果,大田试验结果表明,生防菌YF发酵液100倍稀释液的促生效果和防病效果最好,党参的存活率最高,为52.07%。根鲜重和干重质量最大,分别为966.7g/m2、310g/m2。3、多粘类芽孢杆菌YF抗菌机理研究:首先将pGFP4412质粒导入多粘类芽孢杆菌YF形成绿色荧光标记菌株,然后将标记菌株YF-pGFP采用灌根的方式接种于党参根部土壤,数天后采用激光共聚焦显微镜检测党参根部菌株YF-pGFP,发现其可以定殖于党参根部表皮,在20d后根表皮观察到的菌株YF-pGFP定殖量减少。第二,采用酶活平板检测发现,菌株YF可产生淀粉酶、蛋白酶、葡聚糖酶、纤维素酶、几丁质酶,这些酶的存在可以有效的抑制病原真菌。第三,采用结晶紫染色法对菌株YF形成的生物膜形成进行定量测定。结果表明在培养基中生长72 h后形成的潜底型生物膜,计算可得SBF为1.406,证实了多粘类芽孢杆菌YF能够形成SBF。第四,多粘类芽孢杆菌YF处理党参后第10d测定过氧化物酶(POD)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)等抗性酶类活性的变化,PAL酶活比对照组增加了3.15倍,POD活性增加了42.86%。证明多粘类芽孢杆菌YF对于党参的防御酶的提高有促进作用,间接提高了党参的抗病能力。第五,多粘类芽孢杆菌YF处理后对尖孢镰刀菌产生的主要毒素镰刀菌酸进行测定,通过镰刀菌酸标准品计算出处理组和对照组的毒素含量,结果表明多粘类芽孢杆菌YF可显著抑制尖孢镰刀菌对镰刀菌酸的分泌。第六,用多粘类芽孢杆菌YF对尖孢镰刀菌做对峙培养后,对尖孢镰刀菌产毒相关基因的表达进行检测,发现基因FPD1、SIX8、SNF1、PL1表达量显著下调,通过基因表达结果表明,多粘类芽孢杆菌对尖孢镰刀菌的致病力具有显著的减弱作用。
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