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柑桔溃疡病是具有毁灭性危害的细菌性病害,给柑桔产业造成了巨大的经济损失。植物基因工程育种具有周期短、可控性强、效率高等优点,通过转基因技术将外源抗病基因导入柑桔,从而培育抗病品种,成为柑桔抗病育种的重要方法。柑桔异源基因比如动物或昆虫抗菌肽基因已被成功用于柑桔抗病基因工程育种中。然而,抗菌肽基因转入植物后所遇到的主要问题就是抗菌肽表达丰度偏低,在植物细胞中不够稳定,容易被细胞内的蛋白酶降解,因而限制了抗菌肽功效的发挥。为了提高抗菌肽基因抗柑桔溃疡病能力,本研究利用可剪切连接肽将不同抗菌肽以及抗菌肽和人溶菌酶融合为一个编码框,构建可剪切杂合抗病蛋白基因,利用农杆菌介导将其导入锦橙中,使抗病融合基因在锦橙中一次表达产生不同抗菌肽和溶菌酶,以期增强抗菌肽的杀菌效果,提高柑桔溃疡病抗性。主要研究结果如下：1.可剪切连接多肽2A和LP4在柑桔中指导目的蛋白剪切效率分析为了评价连接多肽2A和LP4对杂合抗病基因翻译后产物剪切的影响,以GFP和GUS为报告基因构建了GFP-2A-GUS和GFP-LP4-GUS杂合基因。构建其超量表达载体,利用农杆菌介导法导入锦橙中,获得转基因植株。提取转基因植株叶片总蛋白,进行蛋白质印记实验。结果表明,连接多肽2A与LP4均能在转基因锦橙中有效剪切杂合蛋白,但2A对融合蛋白的剪切效果明显强于LP4。因此,在构建融合基因用于转化柑桔时,2A更适合作为连接多肽。2.CB-2A-HL、CB-2A-AP6、CB-2A-AP5杂合抗病基因的构建根据上述研究结果,以2A为连接多肽,将抗菌肽CecropinB (CB)、 AP00355 (AP5)、AP01065(AP6)及人溶菌酶(HL)融合,构建了三个融合基因CB-2A-HL、 CB-2A-AP6、CB-2A-AP5。其中,在CB基因的5’端引入胞外分泌信号肽AAT序列,在AP5、AP6以及HL基因的5’端引入胞外分泌信号肽PRla序列。3.植物表达载体p35S:CB-2A-HL、p35S:CB-2A-AP6、p35S:CB-2A-AP5的构建及柑桔的遗传转化以植物表达载体pLGNL为骨架,构建了CaMV35S启动子分别调控CB-2A-HL、CB-2A-AP6、CB-2A-AP5基因表达的植物表达载体p35S:CB-2A-HL、p35:CB-2A-AP6、p35S:CB-2A-AP5。利用农杆菌介导法将这些植物表达载体转入锦橙中,GUS组织化学染色和PCR分析鉴定转基因植株。共获得p35S:CB-2A-HL转基因植株36株,p35S:CB-2A-AP6转基因植株25株,p35S:CB-2A-AP5转基因植株16株。PCR定量分析结果表明,抗病基因在转基因植株的RNA水平上得到了表达。4.抗病增强的转基因植株的筛选采用针刺法对77株转基因植株进行离体接种实验,筛选获得6株溃疡病抗性增强的植株。