目前,非传染性疾病是造成全球大多数死亡的原因。癌症预计将会成为21世纪世界各国的主要死亡原因和增加预期寿命的最重要的障碍。根据世界卫生组织（WHO）2015年的估计,癌症是172个国家中91个国家70岁以前死亡的第一或第二大原因,在其他22个国家中排名第三或第四。其中,肺癌和肝癌的发病率及死亡率位居前列。尽管采用了包括手术、化疗、放疗、靶向治疗、免疫治疗等在内的多种治疗手段,远处转移仍是导致肿瘤治疗失败的主要因素。因此,阐明肿瘤转移的分子机制及鉴定新的分子标志物具有重要的临床意义。本论文主要包括两部分研究内容,分别阐明了CDP138作为一种癌蛋白而LZTS2作为一种抑癌蛋白,在肿瘤的侵袭与转移中的作用及机制。本论文旨在筛选肺癌和肝癌中新的转移标志物。本论文的完成有望成为肿瘤患者,特别是为肿瘤转移患者提供新的治疗靶标。第一部分:CDP138激活TGF-β/Smad信号促进肺癌侵袭转移的作用机制研究目的:肺癌是目前对人类健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一,根据2015年中国肿瘤数据分析显示,肺癌死亡率已居我国男、女恶性肿瘤的首位。尽管采取了多种治疗手段,肺癌转移的发生仍是导致其治疗失败的重要因素之一。因此,鉴定肺癌转移标志物并阐明其作用机制具有重要的理论意义和临床价值。本课题组前期研究结果显示CDP138（C2 domain-containing phosphoprotein）作为周期蛋白依赖性蛋白激酶CDK5的结合蛋白之一,参与调控乳腺癌细胞的增殖和迁移,提示其是一种潜在的肿瘤转移靶标。然而,CDP138在肿瘤转移中的作用和具体机制尚未完全阐明。本研究的目的在于探讨CDP138在肺癌转移中的分子机制和临床意义。方法:Western Blot检测CDP138在人支气管上皮样细胞和肺癌细胞系中的表达情况。通过免疫组化检测CDP138在肺癌及其癌旁组织中的表达情况,结合随访资料分析CDP138的临床意义和预后价值。利用siRNA或shRNA技术靶向沉默CDP138,探讨CDP138对肺癌细胞生长增殖的影响。Transwell实验研究CDP138迁移和侵袭能力的改变。采用基因芯片对CDP138下游效应靶分子进行筛选,并用Real-time PCR和Western Blot技术对其进行验证。通过Rescue实验（挽救实验）验证CDP138发挥其生物学功能是否依赖于下游效应靶蛋白GDF15。结果:Western Blot结果显示与人支气管上皮样细胞HBE相比,CDP138在肺癌细胞系中的蛋白表达水平增高。肺癌及其癌旁组织免疫组化染色显示CDP138在肺癌组织中高表达,其染色定位于细胞浆,且CDP138的表达情况与肺癌患者淋巴结转移相关。靶向沉默CDP138之后,肺癌细胞H1299和HCC827的生长增殖和侵袭迁移能力减弱。经基因芯片筛选、Real-time PCR和Western Blot验证发现GDF15是CDP138的下游效应分子。进一步机制研究显示CDP138可以正向调控TGF-β/Smad信号通路,上调该信号通路中p-Smad2的蛋白表达水平。Rescue实验证实了CDP138发挥其生物学功能主要依赖于GDF15。结论:CDP138在肺癌细胞及肺癌组织中高表达,其表达与肺癌患者的淋巴结转移相关。CDP138通过上调下游效应分子GDF15激活TGF-β/Smad信号通路,从而促进肺癌细胞的生长增殖和侵袭转移。CDP138作为一种潜在的癌蛋白,有望成为肺癌治疗的新靶标。第二部分抑癌蛋白LZTS2的泛素化修饰在肝癌形成及侵袭转移中的作用机制研究目的:目前原发性肝癌的死亡率位各种居恶性肿瘤死亡率的第四位。手术切除、射频消融、放化疗和靶向治疗是肝癌治疗的主要手段。然而,由于术后复发及远处转移的发生,肝癌患者的总体预后仍然很差。因此,鉴定肝癌侵袭转移新的分子标志物具有重要意义。LZTS2（leucine zipper tumor suppressor 2）是一种含亮氨酸拉链结构的蛋白,多项研究表明LZTS2可能作为抑癌蛋白在人类肿瘤的发生发展中起着关键作用。本课题组前期研究结果显示LZTS2可以与PI3K亚基p85相互作用,并抑制PI3K/AKT信号通路的活化,从而调控鼻咽癌的发生发展和放疗抵抗。在此基础上继续深入研究发现:敲低LZTS2可明显增强肝癌细胞的迁移和侵袭能力,提示LZTS2可能与肝癌的侵袭转移相关。本研究的目的在于阐明LZTS2在肝癌侵袭转移中的作用及其具体调控机制。方法:利用免疫组化探讨LZTS2在肝癌及其癌旁组织中的表达情况。Kaplan-Meier法分析LZTS2的表达与患者预后的关系。运用免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,Co-IP）实验验证LZTS2与β-Trcp之间的相互作用并筛选其上游蛋白激酶。应用体内泛素化实验检测LZTS2是否可以被β-Trcp泛素化降解。采用蛋白质半衰期实验检验β-Trcp对LZTS2半衰期的影响。同时,利用定点突变技术明确LZTS2的磷酸化位点。Western Blot检测LZTS2对下游信号通路和EMT相关分子标志物的影响。采用细胞免疫荧光探究LZTS2对Snail和Slug的影响。通过siRNA靶向沉默LZTS2在肝癌细胞系中的表达,探讨LZTS2在肝癌中的生物学功能。采用克隆形成实验和Ed U实验检测LZTS2对肝癌细胞增殖能力的影响。利用Transwell迁移和侵袭实验探究LZTS2对肝癌细胞侵袭迁移能力的影响。构建裸鼠皮下移植瘤模型和肺转移模型,从动物水平进一步验证LZTS2的功能。最后,采用Rescue实验探明LZTS2的泛素化降解对肝癌生物学功能的影响。结果:免疫组化结果显示与正常肝组织相比,LZTS2在肝癌组织中低表达。Kaplan-Meier生存分析显示LZTS2的表达量越高,肝癌患者的生存时间越长。进一步研究发现LZTS2与β-Trcp之间存在相互作用,β-Trcp能够负向调控LZTS2的蛋白表达水平。沉默β-Trcp可以减弱LZTS2的泛素化水平并延长其半衰期。LZTS2能够与上游蛋白激酶CK1δ结合,使其第220位、第224位、第273位、第277位丝氨酸磷酸化。在E3泛素连接酶β-Trcp和激酶CK1δ的协同作用下,LZTS2经泛素-蛋白酶体系统降解。LZTS2负向调控PI3K/AKT信号通路。沉默LZTS2后,Snail和Slug蛋白表达水平及免疫荧光信号更强。靶向沉默LZTS2增加肝癌细胞的克隆形成数目和Ed U形成数目。采用小动物活体成像技术进一步研究显示与正常对照组相比,沉默LZTS2组裸鼠瘤体的荧光信号更强。Transwell迁移和侵袭实验、动物实验共同显示沉默LZTS2增加肝癌细胞的侵袭转移能力。Rescue实验证明了通过活化p85依赖的PI3K/AKT信号通路,LZTS2的泛素化降解可以促进肝癌的形成和转移。结论:LZTS2与CK1δ之间存在相互作用,并且在蛋白激酶CK1δ的作用下,LZTS2的第220位、第224位、第273位、第277位丝氨酸发生磷酸化,进一步被E3泛素连接酶β-Trcp识别并结合,从而导致其被泛素-蛋白酶体系统降解。LZTS2表达降低后,可以活化p85依赖的PI3K/AKT信号通路,最终促进肝癌细胞的生长增殖及侵袭转移。LZTS2的低表达与肝癌患者的不良预后相关,提示LZTS2可能成为肝癌转移患者治疗的新靶标。