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目的：柯萨奇病毒B组3型(Coxsackievirus group B type3， CVB3)是引起人类病毒性心肌炎的主要病原体。VP1是CVB3的主要衣壳蛋白，含有几个T细胞和B细胞表位，免疫原性强，可刺激机体产生保护性的中和抗体。但国内外研究表明，编码VP1的DNA疫苗免疫小鼠后虽然可诱导机体产生中和抗体，但效价比较低，不能有效阻止致死量CVB3的感染。因此，如何增强VP1基因的免疫原性，提高免疫保护作用是当前倍受关注的问题，也是本室近几年的研究重点。
本室曾采用DNA疫苗的靶向策略[51，将巨噬细胞源趋化因子(MDC)与VP1基因融合，构建成融合DNA疫苗pcDNA3/MDC-VP1，对致死量的CVB3攻击的保护率有一定程度的提高，但仍达不到实用程度。本室曾尝试利用IL-2、IL-18、GM-CSF等细胞因子作为基因佐剂，来提高pcDNA3/MDC-VP1融合DNA疫苗的免疫原性，都有一定的效果，但仍不能有效阻止致死量病毒感染。
IFN-γ是一种能对多种细胞产生上调和诱导MHC-Ⅰ、Ⅱ类分子作用的细胞因子。MDC对抗原提呈细胞(APC)的趋化作用，更好的发挥干扰素的免疫增强作用，同时介导VP1进入APC细胞，从而促进抗原加工递呈。另外MDC对Th2细胞具有趋化作用，这将增加APC和Th2细胞的结合机率，从而增强VP1引起的免疫效应。本研究联合应用MDC和IFN-γ，构建了真核表达质粒pcDNA3/MDC-IFN-γ-VP1，通过免疫小鼠后诱导的特异性免疫应答水平和病毒攻击后免疫保护作用来观察接种后的免疫效果。
方法：(1)利用本室前期构建的pcDNA3/IFN-γ质粒，用自行设计的IFN-γ特异性引物进行PCR扩增；(2)将扩增产物与pMD18-T载体连接，构建质粒pMD18-T/ IFN-γ，转化DH5α大肠杆菌，筛选重组子，提取质粒进行酶切鉴定和测序；(3)取酶切的IFN-γ片段与经过同样酶切的pcDNA3[MDC-VP1载体连接，经过转化、筛选和酶切鉴定后，构建真核表达重组质粒pcDNA3/MDC-IFN-γ-VP1，并进行测序；(4)用碱裂解法从转化的DH5α大肠杆菌中大量提取质粒pcDNA3/MDC-IFN-γ-VP1、pcDNA3/MDC-VP1、pcDNA3/VP1和pcDNA3/IFN-γ，用聚乙二醇(PEG)沉淀法进行纯化；(5)动物实验：将6～8周龄雄性BALB/c小鼠随机分为5组，每组23只；分别为生理盐水对照组、pcDNA3/VP1对照组、pcDNA3/IFN-γ对照组、pcDNA3/MDC-VP1对照组、pcDNA3/MDC-IFN-γ-VP1组。纯化后的质粒以生理盐水稀释后，股四头肌注射免疫小鼠，每次每只接种100ug，每3周免疫一次，共免疫3次；每次免疫后第20天，眼眶静脉采血，分离血清，用微量中和试验（固定病毒-稀释血清法）检测血清中CVB3特异性中和抗体。第三次免疫后3周，每组3只小鼠取脾脏制备淋巴细胞悬液，采用细胞计数试剂盒(cell counting kit-8， CCK-8)法进行特异性淋巴细胞增殖活性和特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte， CTL)杀伤活性的检测；另每组20只小鼠用5LD50CVB3进行腹腔注射，观察并记录小鼠存活情况至感染后第21天。
结果：(1)用自行设计的IFN-γ特异性引物经PCR扩增出了IFN-γ基因片段，基因片段的长度与预期结果符合。(2)成功构建原核克隆载体pMD18-T/IFN-γ，DNA测序证实目的基因序列与Genbank登录序列相同。(3)基因序列插入pcDNA3/MDC-VP1后，酶切和测序结果证实成功构建了pcDNA3/MDC-IFN-γ-VP1。(4)各次免疫后血清CVB3VP1特异性IgG水平分别为：pcDNA3/MDC-VP1组1:7.07，1:16.82，1:28.28；pcDNA3/MDC-IFN-γ-VP1组1：7.32，1：18.02，1:29.28;其余组各次平均效价均低于1:5。单因素方差分析表明，三次免疫后以上两组中和抗体滴度逐次增加，但两组之间无统计学差异。其他各组间无差异。(5)小鼠脾淋巴细胞增殖活性经单因素方差分析表明，以CVB3刺激时，pcDNA3/MDC-IFN-γ-VP1组高于pcDNA3/MDC-VP1组(P＜0.05);以ConA刺激时，两组无差异。(6)小鼠脾淋巴细胞特异性CTL杀伤活性经单因素方差分析表明，pcDNA3/IFN-组、pcDNA3/MDC-IFN-γ-VP1组均高于pcDNA3/MDC-VP1组(P＜0.05)。(7)用5LD50CVB3攻击小鼠，各组平均存活率分别为：生理盐水对照组10％，pcDNA3/IFN-γ组20％，pcDNA3/VP1组15％,+pcDNA3/MDC-VP1组40％,pcDNA3/MDC-IFN-γ-VP1组35％。
结论：(1)成功构建了原核表达质粒pMD18-T/IFN-γ。(2)成功构建了真核表达质粒pcDNA3/MDC-IFN-γ-VP1。(3)用致死量CVB3攻击小鼠后，各组均未能有效的增强小鼠的免疫保护作用，不能预防致死量CVB3感染。(4)小鼠免疫后血中中和抗体滴度随免疫次数的增加而提高。(5)pcDNA3/MDC-IFN-γ-VP1免疫组诱导的小鼠脾脏淋巴细胞增殖活性和特异性CTL杀伤活性高于pcDNA3/MDC-VP1免疫组。(7)通过中和抗体滴度、特异性淋巴细胞增殖指数、特异性CTL杀伤活性实验，证明pcDNA3/MDC-IFN-γ-VP1融合疫苗免疫小鼠后，免疫保护作用有一定的提高。