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一研究背景人体对药物反应(包括药代动力学和药效学)的巨大个体差异源于机体内各种功能蛋白的分子变异。有关分子变异的研究,主要集中在基因变异对于上述蛋白的表达和功能的影响。虽然肝药酶的基因多态性已有广泛研究,但是有关肝肾转运体的基因变异研究较少。根据药物的转运方式,药物转运体可分为外排转运体(MDR1 MRP、BCRP等)和摄取转运体(OATP、OAT1等)两种主要类型,药物摄取和外排转运体的联合作用是药物吸收和消除过程中的关键性因素。OATP1B1/BCRP/MRP2组合代表了在有机阴离子药物肝脏转运中起重要作用的三大转运体。药物先经由OATP1B1摄取,随后通过BCRP或MRP2排泄,构成了药物肝胆排泄的矢量转运过程。它们的转运功能受各自特定的基因多态性影响,并直接影响底物药物的药物代谢特征及其药理、毒理效应。系统研究OATP1B1/BCRP/MRP2转运体基因多态性对底物药物体内过程的影响十分重要。目前国外有关OATP1B1/BCRP/MRP2转运体基因多态性影响心血管药物的综合研究多处于体外细胞水平,而在人体整体状态下进行该转运体组合对药物体内过程的影响研究较少,国内此方面的研究尚为空白。鉴于OATP1B1/BCRP/MRP2在介导人体生理功能和药理效应中的重要作用,及其在药物肝胆转运矢量过程中的协同作用,本课题选择OATP1B1/BCRP/MRP2在心血管药物中的共同底物缬沙坦、匹伐他汀、瑞舒伐他汀和依那普利作为研究药物,系统研究OATP1B1/BCRP/MRP2各等位基因多态性在药物体内过程中的作用,明确主要效应基因,探讨临床用药出现个体差异的机制,为临床实施基因导向性个体化用药提供依据。二研究内容及结果本研究包括5部分内容,共入选136名受试者,在查明OATP1B1 BCRP和MRP2常见基因突变在中国汉族人群分布特征的基础上,通过严格设计的临床试验,在人体整体水平下,探讨OATP1B1/BCRP/MRP2基因多态性对临床重要的心血管药物底物(依那普利、缬沙坦、匹伐他汀、瑞舒伐他汀)体内转运过程的综合影响。第一部分OATP1B1.BCRP和MRP2基因多态性在中国汉族人群中的分布研究目的查明OATP1B1、BCRP和MRP2的主要突变位点(OATP1B1:521T>C和388A>G；BCRP:421C>A和34G>A:MRP2:-24C>T和3972C>T)在中国健康男性汉族人群中的分布。研究方法1.研究对象：招募136名汉族健康男性受试者,彼此间无血缘关系。2.基因多态性检测：采用直接测序法对以下各转运体相关位点进行基因分型,包括：(1)有机阴离子转运多肽OATP1B1:521T>C和388A>G:(2)乳腺癌耐药蛋白BCRP:421C>A和34G>A；(3)多药耐药相关蛋白MRP2:-24C>T和3972C>T.研究结果1.在健康中国男性人群中,OATP1B1 521T>C和388A>G突变等位基因的发生频率为11.8%和73.2%。2. BCRP 421C>A和34G>A突变等位基因的发生频率为30.5%和34.6%。3.MRP2-24C>T和3972C>T突变等位基因的发生频率为18.8%和19.5%。4.以上基因突变均为中国人群中的常见突变,其发生频率与日本、韩国等亚裔人种接近,但与白种人和黑人显著不同,可反映中国人群基因频率分布特征。第二部分OATP1B1和MRP2基因多态性对依那普利人体药代动力学的影响研究目的探讨OATP1B1和MRP2基因多态性对依那普利及其活性代谢物依那普利拉人体药代动力学的影响。研究方法1.研究对象：共32名健康男性受试者入选本研究。按以下方式分组：(1) OATP1B1 521T>C基因型：521TC-CC突变组(n=6),521TT野生组(n=26)；(2)为研究MRP2影响,在排除OATP1B1 521T>C变异影响后,对521TT野生型受试者(n=26)按MRP2-24C>T位点进行分组：-24CC野生型(n=16),-24CT+TT突变型(n=10)。2.试验设计：受试者每日口服规定剂量的依那普利,连续7天；采用液相色谱-串联质谱联用法(HPLC-MS/MS)同时测定血浆中的依那普利和依那普利拉浓度。研究结果1.受试者单次和连续口服依那普利后,OATP1B1521TC-CC突变组的依那普利血药浓度显著高于521TT野生组(P=0.048)。2.与依那普利相反,依那普利拉在521TC-CC突变组的AUC和Cmax显著低于521TT野生组(P=0.040和0.027)。3.对于521TT野生纯合子受试者,未发现依那普利和依那普利拉的PK参数与388A>G有关。4. MRP2-24C>T基因多态性不影响依那普利原型的体内动力学,但依那普利拉在-24CC野生型组的AUCss和Cav均显著高于-24CT-TT突变组(P=0.038)。第三部分OATP1B1388A>G和MRP2基因多态性对缬沙坦人体药代动力学的影响研究目的观察OATP1B1388A>G和MRP2-24C>T基因多态性对中国健康受试者缬沙坦药代动力学的影响。研究方法1.研究对象：入选23名OATP1B1521TT野生型受试者,按以下方式分组：(1)OATP1B1388A>G基因型：388GG突变纯合子组14名,388AA-AG杂合子组9名。(2)MRP2-24C>T基因型：-24CC野生型(n=15),-24CT-TT突变型(n=8)。2.试验设计：受试者单剂量口服缬沙坦80 mg,采用HPLC-MS/MS法测定血浆缬沙坦浓度。研究结果1. OATP1B1388A>G显著影响缬沙坦主要PK参数,388AA-AG组的AUCo-48和AUC0-∞较388GG组高51%,Cmax较388GG组高39%,t1/2和tmax在2组之间未显示出差异(P>0.05)。2.缬沙坦各PK参数在MRP2-24CC野生组和-24CT-TT突变组之间无显著性差异(P>0.05)。第四部分OATP1B1和BCRP基因多态性对匹伐他汀人体药代动力学的影响研究目的比较研究OATP1B1和BCRP基因多态性对匹伐他汀及其主要代谢物匹伐他汀内酯人体药代动力学的影响。研究方法1.研究对象：入选24名健康男性受试者,经基因分型检查分为以下3组：GrOup 1:OATP1B1 521TT野生型/BCRP 421CC野生型,n=7；Group 2:OATP1B1 521TC-CC突变型/BCRP 421CC野生型,n=6；Group 3:OATP1B1 521TT野生型／BCRP 421CA-AA突变型,n=11；2.试验设计:受试者单剂量口服匹伐他汀2 mg,采用HPLC-MS/MS法同时测定血浆匹伐他汀及其内酯型代谢物浓度。研究结果1.在排除BCRP 421C>A影响后,匹伐他汀在OATP1B1 521TT野生型纯合子组(Group 1)的AUCo.t(P=0,012)和Cmax(P=O.007)显著低于521TC+CC突变组(Group 2)；2.排除OATP1B1 521T>C影响后,匹伐他汀的主要PK参数(AUC0-t、AUC0-∝、Cmax.Tmax和t1/2)在BCRP 421CC野生纯合子组(Group 1)和421CA+AA突变组(Group 3)之间无显著性差异(P>0.05)；3.匹伐他汀内酯的主要PK参数在3组间无显著性差异(P>0.05)。第五部分OATP1B1/BCRP/MRP2基因多态性对瑞舒伐他汀人体药代动力学的影响研究目的比较研究OATP 1B1/BCRP/MRP2基因多态性对瑞舒伐他汀单剂量和多剂量连续给药后人体药代动力学的影响。研究方法1.研究对象：共24名健康男性受试者入选本研究。按以下方式分组：(1)OATP1B1 521T>C基因型：521TT野生组(n=15),521TC+CC突变组(n=9)；(2)BCRP 421 C>A基因型：421CC野生组(n:15):421CA+AA突变组(n=9)；(3)MRP2-24C>T基因型：-24CC野生组(n=13),-24CT+TT突变组(n=11)。2.试验设计：受试者每日口服规定剂量的瑞舒伐他汀,连续7天；每日按规定时间点采集受试者血样和尿样；采用液相色谱-串联质谱联用法(HPLC.MS/MS)测定血浆和尿样中的瑞舒伐他汀浓度。研究结果1.单剂量给药后,瑞舒伐他汀在BCRP 421CA+AA突变组的AUCO-t、Cmax和尿药排泄百分数Percent excretion显著高于421CC野生型组(P=0.030、0.015和0.041),半衰期t1/2和达峰时间Tmax在两组人群中无差异(P>0.05)。2.与单剂量结果不同,多剂量连续给药达稳态后,稳态AUCss、Cmax、总清除率CLtotal_ ss/F和肾清除率CLR ss在野生型组和突变组之间均无显著性差异(P>0.05),但半衰期t1/2在野生组显著延长(14.1±3.1 vs 11.8±2.2 h,P=O.035),且野生组的蓄积比Rac也高于突变组(P=0.064)。3.此外,瑞舒伐他汀的各主要PK参数(AUC、Cmax、Tmax、tl/2、CLtotal/F、CLR、Percent excretion)在OATP1B1 521TT野生组和521TC+CC突变组之间,以及在MRP2-24CC野生组和MRP2-24CT+TT突变组之间无显著性差异(P>0.05)。三研究结论1.OATP1B1和MRP2基因多态性可显著影响依那普利和依那普里拉的体内PK特征,依那普利拉在同时具有OATP1B1 521TT野生型和MRP2-24CC野生型受试者体内的暴露量显著高于这两个转运体位点均发生突变的受试者。2.在排除OATP1B1 521T>C基因多态性的影响后,388A>G基因多态性是影响缬沙坦药代动力学特性的重要因素；而MRP2-24C>T基因多态性对缬沙坦药代动力学无影响。3.OATP1B1基因多态性显著影响匹伐他汀人体药代动力学特征,但对匹伐他汀内酯无影响；BCRP 421C>A突变与匹伐他汀及其内酯的药代动力学改变无关。4.与匹伐他汀不同,BCRP 421C>A基因多态性是影响瑞舒伐他汀人体药代动力学改变的重要因素；MRP2-24C>T和OATP1B1 521T>C变异对瑞舒伐他汀体内PK特征影响不显著,且与BCRP 421C>A无协同作用。5.对于复杂人体,转运体基因多态性对不同底物药物的影响存在很大差异,单一转运体多态性仅能解释部分个体差异原因。