研究背景当今社会中,由于感染、创伤、骨肿瘤骨病切除等往往造成骨组织的缺损,对于常规的骨缺损,经过积极治疗后常常能够获得较理想的治疗效果,但是对于大段骨组织的缺失（等于或者大于长骨直径的1.5倍）,即使经过积极治疗也难以获得良好的治疗效果,尤其是负重部位的大段骨缺损,更是困扰着医学研究人员。虽然目前已经有较多人工骨移植材料被研发,但是它们或多或少存在一定的缺陷,例如移植材料的强度有限或者虽具有较好的强度但是缺乏活性,甚至既具有了好的强度也有了不错的生物活性但是仍然难以满足临床上的应用。近年来,多孔钛合金技术的发展给大段骨缺损的治疗带来了新的治疗思路,多孔钛合金具有良好的生物相容性、耐腐蚀性、高的机械强度,同时其整体弹性模量可以根据骨的弹性模量通过调节孔径大小、连通径大小以及孔隙率的高低来做出调整。而且,多孔结构不仅能够作为营养物质运输的有效通道,而且为新生骨组织的长入也提供了良好的空间,因此将多孔钛合金作为治疗负重部位大段骨缺损的基底材料不失为一种不错的选择。但是,多孔钛合金属于生物惰性材料,其植入体内后,不能很好地诱导骨组织长入,骨与材料界面难以达到理想的整合效果。因为机体内一切生命活动都有赖于微弱生物电活动,因此提高多孔钛合金的生物电活性或许能够改善其成骨活性。目前,压电陶瓷是一种良好的力-电转换材料,在其受到外界力的作用并发生形变时（即使是极其微小的形变）在其周围会产生微弱的电流;而当其处在电场中时,其亦会发生形变,从而实现力-电之间的互相转换。因此,如果能将压电陶瓷作为涂层制备于多孔钛合金表面,其在力的作用下能够很好的改善多孔钛合金的生物电活性。目前,医学领域中对压电陶瓷已有了大量研究,但是只有钛酸钡压电陶瓷研究和应用的最为广泛,而且其作为涂层的制备工艺也更为成熟。钛酸钡压电陶瓷具有良好的生物相容性和压电特性,作为涂层的制备方法包括等离子喷涂、火焰喷涂等,但是这些方法所制备的涂层厚度和分布多不够均匀,涂层结合多不牢固。水热合成法通过化学合成的方法,能在多孔钛合金表面原位生成厚薄均匀的钛酸钡涂层,并且结合稳定牢固。低强度脉冲超声波已经被美国食品和药品管理局（FDA）批准用于治疗临床上新鲜骨折以及骨不连等,证明低强度脉冲超声波本身能够促进骨组织的再生。另外,低强度脉冲超声波作为一种微弱的机械力,其作用于压电陶瓷后,能够使其发生形变从而产生压电效应,压电效应所产生的微电流进一步刺激新骨的形成。因此,本实验将钛酸钡压电陶瓷涂层制备于多孔Ti6Al4V支架表面后,并将低强度脉冲超声波作用于涂层修饰后的支架,观察和评估了体外的细胞学效应和体内修复大段骨缺损的效果。研究目的将钛酸钡压电陶瓷涂层制备于多孔Ti6Al4V支架表面,对修饰后支架的自身特性和表面特性与单纯多孔Ti6Al4V支架进行对比;检测低强度脉冲超声波作用于修饰前支架和修饰后支架对于体外细胞生物学特性的影响;检测低强度脉冲超声波作用于修饰前支架和修饰后支架对于体内大段骨缺损治疗效果,包括骨量增长的多少和骨与支架的整合程度。研究方法1)通过电子束熔融技术制备两种不同规格的多孔Ti6Al4V支架,即体外细胞实验所用支架直径12mm,高2mm和体内动物实验所用支架直径5mm,高13mm,孔径大小设计为700μm,孔隙率为70%,横梁直径为380μm。通过水热合成法在支架表面制备钛酸钡压电陶瓷涂层,并利用扫描电镜、普通能谱分析和X射线光电子能谱分析检测涂层是否制备成功。通过水接触角和表面粗糙度比较涂层修饰前后,多孔Ti6Al4V支架表面特性的变化。通过Micro-CT扫描比较了修饰前后多孔Ti6Al4V支架的孔径、连通径、孔隙率以及横梁大小的变化。通过力学测试评价涂层修饰前后,多孔Ti6Al4V支架弹性模量和强度的变化。2)将低强度脉冲超声波作用于涂层修饰前后的多孔Ti6Al4V支架,并将兔骨髓间充质干细胞种植于支架表面。根据超声波条件的加载与否,实验被分为BaTiO₃/pTi+LIPUS组、BaTiO₃/pTi组、LIPUS+pTi组和pTi组四组。并在培养4天和7天时利用CCK-8检测了细胞的增殖活性;在4天时利用SEM,在4天和7天时利用荧光染色观察了细胞的基本形态和黏附活性;在4天时利用流式细胞仪,在4天和7天时利用细胞死活荧光染色分析了细胞的死亡和凋亡情况;在7天和14天时,分别利用碱性磷酸酶活性和成骨相关基因的PCR结果评估了细胞的成骨分化情况。3)建立新西兰大白兔桡骨中段大段骨缺损的模型,并将钛酸钡压电陶瓷涂层修饰前后的多孔Ti6Al4V支架分别移植于骨缺损处,术后给予低强度脉冲超声波刺激。根据是否加载超声刺激,实验同样被分为BaTiO₃/pTi+LIPUS组、BaTiO₃/pTi组、LIPUS+pTi组和pTi组四组。在术后6周和12周分别取材,通过影像学X线平片和Micro-CT扫描分析了材料内部骨组织的再生情况,通过荧光标记计算了骨矿化沉积率的快慢,通过组织学切片VG染色进一步分析了新生骨组织的生长状况和骨-支架界面的骨整合情况,通过生物力学检测了最大拔出力。研究结果1)通过SEM、SEM自带的能谱分析仪和XPS检测,发现钛酸钡压电陶瓷涂层被成功制备于多孔Ti6Al4V支架表面;水接触角结果显示,钛酸钡压电陶瓷涂层改善了多孔Ti6Al4V支架表面的亲水性;表面粗糙度结果表明,钛酸钡涂层修饰后的支架有了更好的表面粗糙度;Micro-CT扫描结果表明,涂层修饰前后支架的孔径、连通径、孔隙率和横梁直径均无统计学意义上的变化;力学测试结果显示,涂层修饰前后支架的弹性模量和力学强度均无明显变化。2)CCK-8结果表明,在4天和7天时,BaTiO₃/pTi+LIPUS组与其它三组比较有了更好的细胞增殖活性（*p<0.05 vs.pTi组,#p<0.05 vs.BaTiO₃/pTi组,+p<0.05 vs.LIPUS+pTi组）,LIPUS+pTi组和BaTiO₃/pTi组的细胞增殖活性高于pTi组（*p<0.05）。扫描电镜发现BaTiO₃/pTi+LIPUS组细胞形态不仅更为饱满,伸展状态良好,而且在支架表面形成的细胞层,LIPUS+pTi组和BaTiO₃/pTi组的细胞状态要好于pTi组。荧光染色后,细胞总面积与细胞核面积之比显示在4天和7天时,BaTiO₃/pTi+LIPUS组的值均高于LIPUS+pTi组（P<0.05）、BaTiO₃/pTi组（P<0.05）和pTi组（P<0.05）,而LIPUS+pTi组和BaTiO₃/pTi组的值仅在7天时在统计学上高于pTi组（P<0.05）。黏着斑蛋白的表达显示,在4天和7天时,Ba TiO₃/pTi+LIPUS组均有较高的表达（*p<0.05 vs.pTi组,#p<0.05 vs.Ba TiO₃/pTi组,+p<0.05 vs.LIPUS+pTi组）,LIPUS+pTi组的表达均高于pTi组（P<0.05）,BaTiO₃/pTi组只在7天时高于pTi组（P<0.05）。流式细胞仪细胞凋亡指数和细胞死活染色结果结果显示,在4天和7天时,BaTiO₃/pTi+LIPUS组（*p<0.05,#p<0.05,+p<0.05）<LIPUS+pTi组（*p<0.05）<BaTiO₃/pTi组（*p<0.05）<pTi组。碱性磷酸酶活性结果显示,在7天和14天时,BaTiO₃/pTi+LIPUS组（*p<0.05,#p<0.05,+p<0.05）>LIPUS+pTi组（*p<0.05）>BaTiO₃/pTi组（*p<0.05）>pTi组。成骨基因RNA表达结果显示,在7天和14天时,对于ALP、RUNX2和COL-1基因的表达来说,Ba TiO₃/pTi+LIPUS组（*p<0.05,#p<0.05,+p<0.05）>LIPUS+pTi组（*p<0.05）>BaTiO₃/pTi组（*p<0.05）>pTi组,但是,对于OPN基因表达来说,Ba TiO₃/pTi组在7天和14天时均大于其他三组（*p<0.05,#p<0.05,+p<0.05）,而LIPUS+pTi组和BaTiO₃/pTi组仅在14天时大于pTi组（P<0.05）。3)影像学检查发现,在6周和12周时,新生骨组织长入的量,BaTiO₃/pTi+LIPUS组（*p<0.05,#p<0.05,+p<0.05）>LIPUS+pTi组（*p<0.05）>BaTiO₃/pTi组（*p<0.05）>pTi组。骨矿化沉积率的计算结果表明,对于新骨生长速度来说,BaTiO₃/pTi+LIPUS组（*p<0.05,#p<0.05,+p<0.05）>LIPUS+pTi组（*p<0.05）>BaTiO₃/pTi组（*p<0.05）>pTi组。组织学VG染色结果与影像学和荧光标记结果相一致,BaTiO₃/pTi+LIPUS组（*p<0.05,#p<0.05,+p<0.05）>LIPUS+pTi组（*p<0.05）>BaTiO₃/pTi组（*p<0.05）>pTi组,另外,BaTiO₃/pTi+LIPUS组、LIPUS+pTi组、Ba TiO₃/pTi组这三组骨整合均较pTi组好。最大拔出力的结果与影像学和组织学保持一致,BaTiO₃/pTi+LIPUS组（*p<0.05,#p<0.05,+p<0.05）>LIPUS+pTi组（*p<0.05）>BaTiO₃/pTi组（*p<0.05）>pTi组。研究结论1)成功在多孔Ti6Al4V支架表面制备了钛酸钡压电陶瓷涂层,而且该涂层在改善多孔Ti6Al4V支架表面的亲水性和表面粗糙度的基础上,并未影响支架本身的特性,包括孔径、连通径、孔隙率、弹性模量、力学强度。2)在体外研究中,钛酸钡压电陶瓷涂层作为独立因素能够改善多孔Ti6Al4V支架上细胞的形态、黏附、增殖和分化;低强度脉冲超声波同样可以作为独立的因素改善多孔Ti6Al4V支架上细胞的生物学表现;当低强度脉冲超声波作用于钛酸钡压电陶瓷涂层时,其改善孔Ti6Al4V支架上细胞生物行为学的能力进一步被提高。3)在体内研究中,钛酸钡压电陶瓷涂层能够作为独立因素提高多孔Ti6Al4V支架内新生骨组织的长入并且促进骨与支架之间的整合;低强度脉冲超声波同样可以作为独立因素改善多孔Ti6Al4V支架内新生骨组织的生成量和骨整合能力;钛酸钡压电陶瓷涂层在低强度脉冲超声波的作用下,其促进骨再生的能力和骨与支架整合的能力进一步被加强,相较于单纯多孔Ti6Al4V支架来说,骨组织的生成量增加了10%-20%。4)多孔Ti6Al4V支架、钛酸钡压电陶瓷涂层、低强度脉冲超声波的结合能显著提高负重部位大段骨缺损的修复效能,为临床应用提供了理论基础。但是,其修复机制尚未完全明了,有待进一步的探究。