论文部分内容阅读
大豆[Glycine max(L.)Merr.]作为最重要的经济作物之一,在大漫长的生长期内,常年遭受严重的虫害侵袭,尤其是暴食性食叶害虫斜纹夜蛾。虫害在造成大规模减产的同时,还引发农民生产成本增加,农田生态系统遭到破坏等连锁问题。有效减少和预防虫害成了能否稳定大豆生产供应的关键因素之一。大约在5000年前,野生大豆[Glycine soja Sieb.&Zucc.]被人类驯化为栽培大豆种植。栽培大豆由于人类不断地定向选择作用,大量的优异变异类型丢失,遗传多样性降低,对各种逆境表现出高度的敏感。而野生大豆材料作为栽培大豆的近缘种,保留了丰富的遗传变异类型,对于各种逆境条件表现出极强的耐受性,是十分珍贵的种质资源,对改良栽培大豆具有极其重要的意义。本研究以野生大豆群体和斜纹夜蛾为研究对象,于2019年在南京江浦农场进行野生大豆群体养虫实验,并结合实验室2014年和2016年养虫数据,利用南京农业大学开发的355K SNP芯片,野生大豆材料广州大学重测序数据(GZUdata)和野生大豆材料黑龙江省农科院重测序数据(HAASdata)进行三年野生大豆养虫数据联合关联分析。同时,基于Du等(2 019)转录组和关联分析的研究结果,挖掘和筛选出GsHsf36.GsHsf06,GsUGT73B3基因,并进行初步的功能研究。主要内容和结果如下:1、通过野生大豆群体养虫实验,获取了群体材料田间虫害指数(IDL),强迫喂养斜纹夜蛾幼虫后第七天幼虫重(LW),斜纹夜蛾幼虫化蛹后第三天蛹重(PW),幼虫从喂养到化蛹所经历的天数(LP)以及根据幼虫重划分的五个抗性等级(RL)。对五个抗性等级进行相关分析,结果显示各抗性指标间显著相关,其中作为抗生性表型性状,幼虫重、蛹重、幼虫历期和抗性等级相关性更大。2、将2019年养虫数据与2014年和2016年养虫数据进行整合,利用355K SNP芯片,GZUdata和HAASdata进行关联分析。结果显示,用355K SNP芯片关联分析,有14个位点在年份间被重复定位到,这些位点主要集中在虫害指数、抗性等级、蛹重、幼虫重等表型性状中,其中有五个标记被同一个表型性状两年重复定位到,分别为 AX-93805238、AX-93995669、AX-93758604、AX-93720079 和 AX-94112110,分别位于3、5、8、12和13号染色体上。用HAASdata进行关联分析,定位到6个重复关联到的位点,其中rs623754标记被同一表型性状连续两年重复定位到,查找rs623754标记前后80kb范围内的基因,共计17个候选基因,其中Glysoja.12G034835基因在野生大豆表达谱中被诱导显著上调表达。用GZUdata进行关联分析,共定位到除茸毛密度表型性状外的重复关联位点17个,在13号染色体上形成了一个SNP簇。虫害指数表型性状年份间重复关联到3个标记S0523291482、S0523291045和S184773182,对S184773182定位区间范围内的基因进行研究,发现区间前后两端的基因Glysoja.18G047622和Glysoja.18G047636在野生大豆表达谱中具有显著表达差异。茸毛密度表型性状共重复关联到38个-Log(P)>5的标记,分布在20号染色体30kb范围内,形成一个SNP簇,查找SNP簇前后80kb范围内的候选基因,发现Glysoja.20G053686基因在野生大豆表达谱中表达量显著上调。3、结合野生大豆表达谱研究结果和荧光定量实验,筛选出Glysoja.19G051443,Glysoja.03G006982和Glysoja.19G050241三个候选基因,通过毛状根强迫喂养斜纹夜蛾幼虫实验,鉴定出Glysoja.19G051443基因具有正调控野生大豆抗斜纹夜蛾功能,该基因属于热激转录因子B3亚家族,将其命名为GsHsf36基因。通过亚细胞定位实验和实时荧光定量实验,发现GsHsf36基因作用于细胞核,在根中表达量较高,在叶片中表达量较低。研究发现GsHsf36基因的同源野生大豆基因GsHsf06基因在野生大豆表达谱中表达趋势与GsHsf36基因类似,在抗性材料虫诱导第三天表达量显著上调。GsHsf06基因也属于激转录因子B3亚家族。为进行后续功能研究,克隆了GsHsf06基因的编码区,并构建了过表达和干扰毛根载体。4、基于关联分析结果的挖掘,发现单年关联到的AX-93785823标记落在了Glysoja.11G028557基因的外显子区域,而Glysoja.11G028557基因在野生大豆表达谱中具有显著表达差异,该基因属于UGT家族D组(UGT73),前人研究表明D组基因与植物抗生物胁迫密切相关。将Glysoja.11G028557基因命名为GsUGT73B3。为进行后续功能研究,克隆了GsUGT73B3基因的编码区,并构建了过表达和干扰毛根载体。