野生大豆群体抗食叶性害虫性状的关联分析及相关抗虫基因功能的初步研究

来源 :南京农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:wangrong2000
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大豆[Glycine max(L.)Merr.]作为最重要的经济作物之一,在大漫长的生长期内,常年遭受严重的虫害侵袭,尤其是暴食性食叶害虫斜纹夜蛾。虫害在造成大规模减产的同时,还引发农民生产成本增加,农田生态系统遭到破坏等连锁问题。有效减少和预防虫害成了能否稳定大豆生产供应的关键因素之一。大约在5000年前,野生大豆[Glycine soja Sieb.&Zucc.]被人类驯化为栽培大豆种植。栽培大豆由于人类不断地定向选择作用,大量的优异变异类型丢失,遗传多样性降低,对各种逆境表现出高度的敏感。而野生大豆材料作为栽培大豆的近缘种,保留了丰富的遗传变异类型,对于各种逆境条件表现出极强的耐受性,是十分珍贵的种质资源,对改良栽培大豆具有极其重要的意义。本研究以野生大豆群体和斜纹夜蛾为研究对象,于2019年在南京江浦农场进行野生大豆群体养虫实验,并结合实验室2014年和2016年养虫数据,利用南京农业大学开发的355K SNP芯片,野生大豆材料广州大学重测序数据(GZUdata)和野生大豆材料黑龙江省农科院重测序数据(HAASdata)进行三年野生大豆养虫数据联合关联分析。同时,基于Du等(2 019)转录组和关联分析的研究结果,挖掘和筛选出GsHsf36.GsHsf06,GsUGT73B3基因,并进行初步的功能研究。主要内容和结果如下:1、通过野生大豆群体养虫实验,获取了群体材料田间虫害指数(IDL),强迫喂养斜纹夜蛾幼虫后第七天幼虫重(LW),斜纹夜蛾幼虫化蛹后第三天蛹重(PW),幼虫从喂养到化蛹所经历的天数(LP)以及根据幼虫重划分的五个抗性等级(RL)。对五个抗性等级进行相关分析,结果显示各抗性指标间显著相关,其中作为抗生性表型性状,幼虫重、蛹重、幼虫历期和抗性等级相关性更大。2、将2019年养虫数据与2014年和2016年养虫数据进行整合,利用355K SNP芯片,GZUdata和HAASdata进行关联分析。结果显示,用355K SNP芯片关联分析,有14个位点在年份间被重复定位到,这些位点主要集中在虫害指数、抗性等级、蛹重、幼虫重等表型性状中,其中有五个标记被同一个表型性状两年重复定位到,分别为 AX-93805238、AX-93995669、AX-93758604、AX-93720079 和 AX-94112110,分别位于3、5、8、12和13号染色体上。用HAASdata进行关联分析,定位到6个重复关联到的位点,其中rs623754标记被同一表型性状连续两年重复定位到,查找rs623754标记前后80kb范围内的基因,共计17个候选基因,其中Glysoja.12G034835基因在野生大豆表达谱中被诱导显著上调表达。用GZUdata进行关联分析,共定位到除茸毛密度表型性状外的重复关联位点17个,在13号染色体上形成了一个SNP簇。虫害指数表型性状年份间重复关联到3个标记S0523291482、S0523291045和S184773182,对S184773182定位区间范围内的基因进行研究,发现区间前后两端的基因Glysoja.18G047622和Glysoja.18G047636在野生大豆表达谱中具有显著表达差异。茸毛密度表型性状共重复关联到38个-Log(P)>5的标记,分布在20号染色体30kb范围内,形成一个SNP簇,查找SNP簇前后80kb范围内的候选基因,发现Glysoja.20G053686基因在野生大豆表达谱中表达量显著上调。3、结合野生大豆表达谱研究结果和荧光定量实验,筛选出Glysoja.19G051443,Glysoja.03G006982和Glysoja.19G050241三个候选基因,通过毛状根强迫喂养斜纹夜蛾幼虫实验,鉴定出Glysoja.19G051443基因具有正调控野生大豆抗斜纹夜蛾功能,该基因属于热激转录因子B3亚家族,将其命名为GsHsf36基因。通过亚细胞定位实验和实时荧光定量实验,发现GsHsf36基因作用于细胞核,在根中表达量较高,在叶片中表达量较低。研究发现GsHsf36基因的同源野生大豆基因GsHsf06基因在野生大豆表达谱中表达趋势与GsHsf36基因类似,在抗性材料虫诱导第三天表达量显著上调。GsHsf06基因也属于激转录因子B3亚家族。为进行后续功能研究,克隆了GsHsf06基因的编码区,并构建了过表达和干扰毛根载体。4、基于关联分析结果的挖掘,发现单年关联到的AX-93785823标记落在了Glysoja.11G028557基因的外显子区域,而Glysoja.11G028557基因在野生大豆表达谱中具有显著表达差异,该基因属于UGT家族D组(UGT73),前人研究表明D组基因与植物抗生物胁迫密切相关。将Glysoja.11G028557基因命名为GsUGT73B3。为进行后续功能研究,克隆了GsUGT73B3基因的编码区,并构建了过表达和干扰毛根载体。
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