唇腭裂是常见的先天性缺陷疾病,其特征为面部组织融合的异常中断。颌面部的形成与各个面部突起密切相关,发育开始于胚胎发育的第三周,此时,额鼻突形成,与此同时,第一对腮弓分叉形成了上下颌突。第五周时,额鼻突两侧各出现一个嗅窝（即原始鼻腔）,并分成了中鼻突,内侧鼻突和外侧鼻突。第六周时,中鼻突分化为两个球状突。第七周时,双侧的下颌突往中线生长,发育形成下颌。胚胎颌面发育于第八周基本完成。此时,继发腭突形成。随后,硬腭和软腭相继发育形成,在第十二周时,胚胎头面部基本具备成人形态。在这段时间内,若受到某些因素的影响,各面突正常发育和融合异常中断,可导致发生相应的颌面部畸形,如两侧下颌突未能融合则会导致下唇裂或者下颌裂,而鼻中隔和前腭突未能与继发腭突融合,则导致腭裂。分子生物学研究发现多种分子参与颌面部早期发育的调控,比如肌节同源盒1（MSX1）,成纤维细胞生长因子（FGFs）等。在我国,罹患唇腭裂的新生儿约占世界总数的三分之一。唇腭裂患者往往都会存在面部结构功能异常,外貌异于常人,甚至导致心理疾病。他们需要序列治疗,多学科联合才能改善,这给患者及其家庭都带来极大的负担。因此,研究唇腭裂的发病机制,有助于我们去发现疾病发生发展的过程,对临床诊断和遗传咨询提供帮助,具有重大意义。据临床表现,唇腭裂分为三种主要类型:唇裂伴腭裂（cleft lip with cleft palate,CLP）,单纯唇裂（cleft lip only,CLO）,和单纯腭裂（cleft palate only,CPO）。非综合征型唇腭裂（nonsyndromic orofacial cleft,NSOC）是不伴有其他发育异常的病例,占了唇腭裂病例的大部分,其余为综合征型唇腭裂（syndromic orofacial cleft,SOC）。NSOC病因构成复杂,主要由遗传和环境因素组成。在所有的NSOC危险因素中,遗传因素在胚胎发育阶段起到了关键作用。NSOC存在遗传异质性,不同地区、种族的发病率不一致。目前,国内外学者对NSOC的遗传机制开展了大量研究,已发现了多个致病因素。对于这种复杂疾病,运用全基因组关联研究（GWAS）鉴别出了多个新的易感位点。首先,学者们证实了两个先前发现的基因可能与唇腭裂有关。高效应的相关位点的发现,证明了IRF6和NSOC的易感性有关,这些研究为证明IRF6基因是NSOC候选基因提供了进一步的证据。此外,最近在一个病例对照研究中,证实了 FOXE1的单核苷酸多态性（SNP）和NSOC发病风险有着显著的关联,从而证明了这种基因是导致NSOC的一个致病因素。除了先前识别的候选基因的确定,Beaty等人还在MAFB中发现了一个和NSOC相关的强信号,在Pax7和Vx1位点上发现了相似强度的信号点,而这个发现已经被很多其他研究者证实。在2012年,有报道指出,在ABCA4周围重排的ARHGAP29基因也是唇裂的一个候选基因。近期的研究还发现了其他的易感基因位点。一项关于NSOC的荟萃分析重复了以前的研究结果,一共在欧洲人群和非洲人群中确定了六个新的候选位点,此外,还发现8q.24区域和NSOC易感性密切相关。这些研究的结果表明,某些位点与特定人群有关。这是由于等位基因频率不同,以及不同种族人群之间的特异性造成了这种差异的存在,而通过对欧洲和南美的高加索人群的8q.24位点和亚洲人的MAFB基因上的易感位点的研究,证实了这种差异的存在。微小RNA（microRNA,miRNA）是内源性,非编码的短（20-30个核苷酸）RNA,参与调节细胞分化,增殖,凋亡或代谢等。动物模型研究发现,miRNA在颅颌面发育中起重要作用。例如,最近的一项研究显示,miRNA-23b和miRNA-133b参与了面中部的发育过程。而miRNAs的合成与成熟离不开其合成通路基因,包括GEMIN3,DROSHA,DGCR8,DICER等。这些基因出现异常,会使miRNAs正常合成过程中断,影响其功能。其中一些基因已经被报道与颅颌面发育相关。DICER是通路中最重要的基因之一,当该基因异常表达,动物模型出现唇腭裂的表型。SNPs已被证实是人类遗传变异的主要类型,根据文献报道,miRNA合成通路基因上的SNPs可能诱导异常剪接,改变蛋白质结合位点或调节基因表达水平。先前的研究已经揭示了这些SNPs与各种常见疾病发生发展的关联性,包括结肠直肠癌和帕金森病等。最近,中国有团队用 GWAS 研究（genome-wide association studies,GWAS）鉴别出 14 个与NSOC相关的新位点,其中有一个位点就位于DICER基因与GSC基因间。鉴于miRNA在颅面结构发育中的重要性,miRNA合成通路基因的遗传变异也可能影响NSOC的易感性。肌肉节段同源盒 1 基因（the muscle segment homeobox1 gene,MSX1）位于4p16.1,编码DNA结合序列,并且在早期发育的关键阶段中,于头面部有表达。它具有高度保守的结构组织,其高表达可以诱导胚胎阶段细胞之间的相互作用。在颅颌面部发育的每个阶段,MSX1均有表达。小鼠中MSX1缺失可导致完全性腭裂,并且伴随其他颅面缺损。且MSX1是BMP以及FGF信号通路中的重要调控因子。小鼠唇腭部形成过程中,MSX1突变会抑制间充质细胞的增殖,同时使腭突上皮细胞早凋,从而发生面突融合异常。MSX1突变与牙齿发育不全或先天缺牙相关。MSX1也已被证明是一个有利的NSOC候选基因。Van den Boogaard等首先在荷兰人中发现了 MSX1与NSOC的发病风险相关。他们在对一个家系研究时发现,其中NSOC患者的MSX1基因存在异常。近年来,已经有多项研究报道了 MSX1与NSOC相关联,然而,不同人群的遗传背景存在种族差异,因此很有必要在中国汉族人群中对MSX1基因多态与NSOC的关系进行验证。本研究分为两个部分:（1）miRNA合成通路基因的SNPs与NSOC易感性的关联研究,（2）位于MSX1功能区的SNPs与NSOC相关性及其作用机制的研究。第一部分miRNA合成通路基因多态与非综合征型唇腭裂易感性的关联研究在颅颌面组织生长发育中,miRNAs发挥了重要作用。而在miRNAs成熟过程中,miRNA合成通路基因不可或缺。因此,我们提出假设:位于miRNA合成通路基因上的SNPs可能与NSOC易感性存在关联。本研究中,我们一共筛选出12个位于6个miRNA合成通路基因（GEMIN3,DROSHA,DGCR8,GEMIN4,PIWIL1,and XPO5）的 SNPs,用病例对照研究验证这些位点与NSOC易感性的关联。研究结果表明,有三个SNPs与NSOC易感性相关。其中,rs417309 GA基因型和GG基因型相比可以降低NSOC的发病风险（P=0.049,OR=0.65,95%CI=[0.43,0.99]）;rs493760,其CC基因型与TT基因型相比较,也可以显著降低 NSOC 发病风险（P=0.020,OR=0.53,95%CI=[0.31,0.90]）。而,rs10719 GA基因型与AA基因型相比,GA基因型可升高NSOC易感性（P=0.022,OR=1.32,95%CI=[1.04,1.68]）,在显性模型中,也表现出相同趋势（GG+GA/AA:P=0.035,OR=1.27,95%CI=[1.02,1.60]）。分层分析结果示,rs10719与CLP亚型相关,杂合型比较和显性模型比较均表现出致病作用（GA/AA:OR=1.50,95%CI=[1.12,2.00];GG+GA/AA:OR=1.39,95%CI=[1.05,1.83]）,rs493760与CLP及CPO均相关,纯合型比较显示保护作用（CLP:OR=0.43,95%CI=[0.21,0.88];CLO:OR=0.89,95%CI=[0.85,0.92]）。而rs417309与CLO,CLP,CPO均无关联性。此外,单倍型分析和联合分析结果均无统计学差异。综上所述,我们的研究结果表明DROSHA rs10719,DROSHA rs493760和DGCR8 rs417309这三个SNPs可能影响中国汉族人群NSOC的易感性。第二部分MSX1遗传变异与非综合征型唇腭裂易感性的机制研究在脊椎动物和哺乳动物中,MSX1基因主要在颅颌面组织和肢芽表达。而MSX1基因变异则可能导致人类的牙齿发育不全,先天缺牙以及唇腭裂。有多篇研究报道了MSX1单核苷酸多态性和NSOC易感性的关系,然而在不同人群中,MSX1起到不一样的作用。在本研究中,我们开展了病例对照研究（包括602例NSOC病例和605例健康对照）,验证了 rs12532,rs3821947,rs3821949以及rs4464513与NSOC之间的关联性。研究结果表明,位于MSX1基因3’-非翻译区（3’-untranslated region,3’-UTR）的位点rs12532可能影响NSOC的易感性。其中rs12532AA基因型患者与 GG 基因相比,可以降低 NSOC 风险（AA vs.GG:OR=0.69,95%CI=[0.49,0.98]）,这种效应在 CLP 亚型中尤其显著（A vs.G:OR=0.80,95%CI=[0.66,0.99];AA vs.GG,OR=0.58 95%CI=[0.37,0.91]）。我们通过生物信息学预测,发现miR-3649可能与rs12532结合。双荧光素酶报告基因实验的结果显示,rs12532 G等位基因型和A基因型相比可以显著地降低mi-3649和MSX1的结合能力。我们的研究结果揭示了 MSX1基因3’UTR区域的rs12532与中国汉族人群非综合征型唇腭裂发病风险相关。该位点通过与miR-3649的相互作用调节MSX1基因的表达水平,从而影响NSOC的易感性。