强心苷（Cardiotonic steroid，Cs）用于治疗慢性充血性心力衰竭（Congestive heart failure，CHF）已有200多年历史，但其加强心肌收缩力的作用机制却一直是人们争论的焦点。一般认为：Cs治疗心衰是因为其抑制衰竭心肌细胞膜上的Na⁺-K⁺-ATP酶（NKA），使细胞内Na⁺增加，通过Na⁺/Ca²⁺交换（NCX），引起细胞内Ca²⁺的升高，并促进肌浆网对钙的摄取及随后的钙释放（CICR）。增加的内钙一方面可以增加心肌收缩力即其治疗作用，另一方面当钙的增加超过了肌浆网的负荷时则表现为其毒性作用，因此，探讨强心苷如何在发挥其正性肌力作用的同时最大限度地减少其毒性是目前急需解决的问题。NKA，即Na/K泵或钠泵，属于P型ATP酶家族蛋白，是镶嵌在哺乳动物细胞膜上的一种蛋白质。它每水解一个ATP分子可将3个Na⁺转运出细胞并移入2个K⁺，从而维持细胞的离子跨膜梯度和电位差。到目前为止，发现Na/K泵是由α、β、γ亚基组成的寡聚体。α亚单位是催化亚单位，主要执行泵的功能。亚基有β₁、β₂、β₃亚基，其蛋白仅跨膜一次，氨基端在细胞内，主要调节α亚基的蛋白构型和活性；γ亚基是FXYD基因编码的跨膜蛋白，与α亚基和亚基结合，组织特异性地调节Na/K泵的转运功能。Na/K泵亚基的多样性决定了不同亚基构成的ATP异构酶广泛分布于不同组织，并发挥重要的生理功能。多种配体，如内源性Na/K泵抑制因子哇巴因、ATP、Na⁺和K⁺等，在膜外区均有结合位点。α亚单位分为α₁、α₂、α₃和α₄四种亚基，其中α₁亚基被认为是“管家”亚基。Na/K泵的表达具有组织特异性和种属差异性：成年大鼠心肌主要表达α₁和α₂亚基，α₃亚基表达消失；而豚鼠心肌则只表达α₁、α₂亚基。催化性α亚基存在10个跨膜结构域（H₁-H₁0），其中H₁-H₂、H3-H4、H₅-H₆、H₇-H₈、H₉-H₁₀间的序列位于细胞膜外，称为膜外区（Fig1），负责Na/K泵的离子转运功能。且迄今为止已发现的四种α亚基（α₁-α₄）中，除α₁亚基广泛分布在各组织外，其它亚型均呈现组织特异性分布特点。α₂亚基主要分布于心脏，脑，骨骼肌，血管平滑肌细胞，眼，脂肪细胞，以及其他一些组织中。α₃亚基是卵巢细胞和神经元所特有，但也存在于白细胞中和一些种属如人等的心脏细胞。α₄亚基特异性存在于精子细胞上。α亚基的组织特异性分布提示其亚型在所表达的组织中具有特定功能。近年来，随着分子生物学技术与传统电生理技术的结合与应用，对心肌的Na/K泵结构―功能关系有了更加深入的认识。关于哇巴因结合位点的研究最早是通过化学标记进行的，这些研究表明哇巴因结合在Na/K泵的α亚基而不是β亚基。点突变研究和氨基酸替代实验证明，当将大鼠Na/K泵H₁-H₂膜外区氨基酸Gln¹¹¹和Asn¹²²双突变为Asp¹¹¹和Arg¹²²时，此Na/K泵对哇巴因的亲和力与野生型Na/K泵相比下降了千倍。由此我们推测，Na/K泵抑制因子对Na/K泵的抑制作用正是通过与Na/K泵α亚单位H₁-H₂膜外区氨基酸的结合实现。提示Na/K泵H₁-H₂膜外区是哇巴因的主要结合位点。除了Na/K泵H₁-H₂膜外区参与哇巴因结合外，其它结构区比如H3-H4及H₅-H₆膜外区，当嵌合在氢钾ATP酶时也表现出与哇巴因的亲和力。根据对强心苷类的亲和力不同，α亚基可分为高亲和力亚型和低亲和力亚型。其中，α₁亚基对强心苷的亲和力明显低于α₂和α₃亚基。例如大鼠心肌细胞α₂亚基仅占11%，给予3×10^-7mol·L^-1OUA能够抑制94%的Na/K泵α₂亚基和1%的α₁亚基，但却使收缩增加约40%，说明α₂亚基在调节心肌收缩方面发挥重要作用。苏素文等在正常或心衰离体豚鼠心脏观察到，低浓度毒毛旋花子苷原（Str）均可在增强心脏收缩功能的同时兴奋或不影响Na/K泵活性，而高浓度则通过抑制Na/K泵引起心肌的不规律的收缩。Str (10μmol·L^-1)在[Ca²⁺]i升高达峰值时,可使细胞挛缩,而Str (10n mol·L^-1)对细胞形态无影响。Gao等提出1^-10nmol·L^-1强心苷能够兴奋Na/K泵，并指出这种兴奋作用与α₂亚基有关，我们实验室也证实10^-1010^-8mol·L^-1DHO（双氢哇巴因，一种强心苷）能够产生外向兴奋性Na/K泵电流，而己有实验证明强心苷有效控制心衰的血清游离药物浓度约为1^-10nmol·L^-1，在豚鼠离体心脏中也证实10^-9mol·L^-1Str能够增强心肌收缩力，而抑制Na/K泵的浓度为10^-7-10-3mol·L^-1，这与传统的理论强心机制相悖。于是对强心苷类药物治疗心衰的真正机制提出了疑问。文献报道Na/K泵特别是抑制α₂亚基调节着哇巴因诱导的心肌收缩力，而抑制α₁亚基则会造成钙超载和非节律收缩，这为我们在治疗心衰过程中寻找特异性作用于α₂亚基的药物提供参考思路。200年前WilliamWitbering开始将洋地黄应用于治疗心力衰竭，到目前为止仍为治疗心力衰竭的主要药物，尤其是对伴有快速性心房颤动的心衰患者。但洋地黄类药物安全范围小，治疗量与中毒量相差不大，用量掌握不好，可致细胞内钙负荷过量，导致心肌收缩过强，心肌负荷过重，易发生各种心律失常，引起中毒乃至死亡，治疗窗较窄使其应用受到很大制约。国外学者研究表明该H₁-H₂结构域对Na/K泵的活性有至关重要的作用，作用在此位点的抗体可以增加钙的流出提高收缩力，同时与该位点的结合既可以提高酶的活性也可以减少酶的活性。说明该结构域对于哇巴因的作用有着非同寻常的意义。因此我们利用作用在α₁及α₂亚基该结构域的多克隆抗体为工具药，分析其是否能够通过减少α₁的毒性或者特异性作用于α₂亚基来寻找更安全的正性肌力作用药物？鉴于以上的研究，本实验共分为三部分：第一部分抗心肌Na/K泵α₁和α₂亚基H₁-H₂结构域的多克隆抗体的制备、纯化及鉴定目的：以Na/K泵α₁和α₂亚基H₁-H₂膜外区氨基酸序列为抗原，免疫新西兰大耳白兔，通过免疫动物获得抗血清制备多克隆抗体，并采用ELISA间接法和免疫印迹及免疫荧光对多克隆抗体的特性进行鉴定，为探明Na/K泵α亚基在细胞内的作用机制，及其与正性肌力发生的关系奠定基础。方法：（1）抗体制备和纯化：用化学法分别合成已知的Na/K泵α₁和α₂亚基H₁-H₂膜外区氨基酸序列作为短肽，并以此作为抗原，对新西兰大耳白兔进行主动免疫获取抗血清制备多克隆抗体，用ProteinA层析柱对抗体进行亲和纯化，间接ELISA法检测免疫后抗血清效价。（2）参照Beatty的方法，采用间接ELISA法测定抗体的效价。（3）采用Western-blotting法检测抗体的特异性。（4）通过细胞免疫荧光法测定抗体的定位。结果：（1）抗体效价、浓度及纯化结果：通过免疫新西兰兔并在第三次加强免疫后获取抗血清制备多克隆抗体，经ProteinA纯化后，抗血清经Protein A纯化后发现，ELISA测定纯化的抗Na/K泵α₁抗体（SSA78）和α（2WJS）抗体浓度分别为0.949mg/ml和1.03mg/ml。SSA78和WJS抗体效价均高达1：240000。（2）Western blot结果显示，SSA78能够像市售α₁亚基抗体一样特异性辨认Na/K泵α₁亚基H₁-H₂膜外区，能够检测到来自大鼠心肌细胞的Na/K泵α₁亚基；而WJS能够像市售α₂亚基抗体一样特异性辨认Na/K泵α₂亚基H₁-H₂膜外区，能够检测到来自大鼠心肌细胞的Na/K泵α₂亚基，表明SSA78和WJS分别具有抗α₁或抗α₂抗体的性质。（3）SDS-PAGE检测显示，纯化后的两种抗体在电泳时分别出现清晰的2条带，其分子量均为110kD左右。（4）通过细胞免疫荧光法测定结果表明，SSA78和WJS抗体均结合在心肌细胞Na/K泵的膜外区，而且这种结合并不被1mM或1μM OUA影响，但却被与它们在H₁-H₂膜外区各自特异性抗原点具有相同成分的多肽阻断剂PB78和RE2取消。小结：上述结果提示，SSA78或WJS能够分别选择性与心肌细胞Na/K泵α₁或α₂亚基H₁-H₂膜外区结合，并与Na/K泵α₁或α₂亚基H₁-H₂膜外区各自的抗原点相互作用。第二部分SSA78和WJS对哇巴因所致Na/K泵电流、细胞内钙及收缩力变化的影响目的：观察SSA78和WJS对哇巴因（ouabain, OUA）引起的大鼠心肌细胞Na/K泵活性的变化，以及哇巴因对细胞内钙及收缩力的影响。方法：在急性分离的大鼠心室肌细胞上，全细胞膜片钳技术记录Na/K泵电流（Ip），观察SSA78和WJS对哇巴因抑制Ip作用的影响。用激光共聚焦显微镜测定心室肌细胞内游离钙浓度([Ca²⁺]i)的大小。利用细胞动缘探测系统测定心肌细胞的长度及收缩力的大小。结果：1当以OUA10^-6mol·L^-1及10^-3mol·L^-1灌流大鼠心室肌细胞时，由于Ip被抑制，可引起膜电流的内向移动；其中10^-6mol·L^-1OUA主要阻断高亲和的泵电流Iph,10^-3mol·L^-1OUA可以阻断总的泵电流Ipt。2预孵抗体SSA78（稀释浓度1:1000）能明显减少10^-3mol·L^-1OUA引起Ipl抑制，而抗体WJS（稀释浓度1:1000）能基本取消10^-6mol·L^-1OUA对Iph的抑制。3OUA (10^-610^-3mol·L^-1)能浓度及时间依赖地增加[Ca²⁺]i，预孵抗体SSA78（稀释浓度1:1000）能部分抑制灌流10^-3mol·L^-1OUA5分钟及15分钟时诱发的[Ca²⁺]i的升高，使其分别降至151.6±4.9%和166.7±10.9%，明显低于未预孵组（249.6±18.3%和281.1±11.4%p <0.05）；但对灌流10^-6mol·L^-1OUA5分钟及15分钟时诱发的[Ca²⁺]i的升高没有影响。而抗体WJS能部分抑制灌流10^-6mol·L^-1OUA5分钟及15分钟时诱发的[Ca²⁺]i的升高，使其分别降为152.6±6.7%和156.0±7.8%，明显低于未预孵WJS时（189.2±14.0%和184.6±8.9%组p <0.05），但对灌流10^-3mol·L^-1OUA5分钟及15分钟时诱发的[Ca²⁺]i的升高没有影响。4抗体SSA78和WJS本身对细胞的收缩力没有显著的影响。5OUA(10^-610^-3mol·L^-1)能够浓度及时间依赖性增加心肌细胞收缩力：10^-6mol·L^-1OUA即能显著性增加心肌细胞的收缩力（5分钟时为142.9±8.3%，15分钟时为141.4±6.6%，P<0.05），10^-3mol·L^-1OUA灌流5分钟时增加的心肌细胞收缩效应为284.6±12.4%（P<0.01）。但灌流15分钟时却使收缩力减少为101.8±3.3%，并引起细胞挛缩死亡，提示10^-3mol·L^-1为OUA的中毒浓度。而预孵抗体SSA78（稀释浓度1:1000）后再给予OUA10^-3mol·L^-1时，其既不影响OUA灌流5分钟引起的心肌细胞收缩力增强，也能显著改善OUA灌流15分钟时引起的收缩力降低（269.7±24.5%，p <0.01）。预孵抗体WJS可明显抑制10^-6mol·L^-1OUA引起的心肌细胞收缩力增强，使OUA灌流5分钟及15分钟时收缩力增强分别降至104.0±2.8%和117.3±6.9%（p <0.05），但WJS并不影响OUA10^-3mol·L^-1对收缩力的作用（p>0.05）。610^-3mol·L^-1OUA引起不规律收缩的起始时间是8.3±0.8min，而预孵抗体SSA78（稀释浓度1:1000及1:100）使10^-3mol·L^-1OUA引起不规律收缩的起始时间延长到11.8±0.8min和11.9±1.0min （p <0.05）；当降低OUA浓度为10^-4mol·L^-1时，其引起不规律收缩的起始时间是10.5±1.1min，而预孵抗体SSA78（稀释浓度1:1000）可使10^-4mol·L^-1OUA在30分钟内没有引起不规律收缩。小结：Na/K泵α₁亚基H₁-H₂膜外区参与OUA致心肌钙超载及不规律收缩，而Na/K泵α₂亚基H₁-H₂膜外区参与OUA增加收缩力的作用，Na/K泵α₁亚基抗体SSA78可保护高浓度OUA导致的心肌损伤，提示Na/K泵α₂亚基介导了OUA的治疗作用，而Na/K泵α₁亚基则与OUA的心脏毒性有关。第三部分SSA78和WJS对OUA所致心肌线粒体功能损伤的影响目的：研究SSA78和WJS对OUA所致大鼠心肌线粒体损伤的影响方法：用激光共聚焦显微镜观测心肌细胞线粒体膜电位（ΔΨm）及线粒体内的Ca²⁺浓度([Ca²⁺]m)；以Rhodamine123为荧光探针，用荧光强度反映线粒体膜电位（ΔΨm）变化；以Rhod-2为荧光探针，用荧光强度反映线粒体[Ca²⁺]m变化；结果：110^-3mol·L^-1OUA可致大鼠心肌线粒体损伤，[Ca²⁺]m增加到302.4±65.3%（p <0.01），ΔΨm降低为45.0±4.4%（p <0.01）。2预孵抗体SSA78可浓度依赖性的升高线粒体膜电位，其中预孵1:1000SSA78可使10^-3mol·L^-1OUA引起的ΔΨm恢复到62.0±5.0%（p <0.05）。3预孵抗体SSA78（稀释浓度1:1000）可减轻10^-3mol·L^-1OUA引起的([Ca²⁺]m)超载为118.8±20.1%（p <0.05）。4WJS对OUA引起的线粒体损伤没有明显的影响。小结：高浓度OUA可引起线粒体钙超载及线粒体膜电位的降低。Na/K泵α₁亚基H₁-H₂抗体SSA78能明显改善OUA所致大鼠心肌线粒体损伤，对OUA致心脏毒性具有保护作用，而Na/K泵α₂亚基H₁-H₂抗体WJS对OUA引起的线粒体损伤没有明显的影响，进一步证明OUA的心脏毒性系由Na/K泵α₁亚基介导。结论1.利用已知的Na/K泵α₁和α₂H₁-H₂膜外区氨基酸序列作为抗原，通过免疫新西兰兔制备多克隆抗体SSA78和WJS具有抗体的特异性。2.高浓度OUA可引起细胞内钙超载、线粒体钙超载及线粒体膜电位的降低，降低Na/K泵活性，损伤心肌细胞收缩力，而Na/K泵α₁亚基抗体能明显改善高浓度OUA所致的上述毒性反应，提示这些毒性反应系由低亲和力Na/K泵α₁亚基介导的。3. Na/K泵α₂亚基抗体不影响OUA引起的收缩力毒性及线粒体损伤，仅取消高亲和力Na/K泵电流和低浓度OUA所致的心肌细胞收缩力增强作用，表明高亲和力Na/K泵α₂亚基介导OUA的治疗作用。