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目的:脆性X综合征(Fragile X syndrome,FXS)是常见的单基因X连锁显性遗传病,其主要发病机制是由于脆性X智力低下基因(Fragile X mental retardation 1,FMR1)的突变甚至缺失造成脆性X智力低下蛋白(Fragile X mental retardation protein,FMRP)表达异常,导致神经系统中抑制与兴奋通路之间的平衡失调。临床主要表现为不同程度的智力障碍、自闭症、焦虑等神经系统症状。脆性X相关基因1(Fragile X related gene 1,FXR1)与FMR1均属于脆性X基因家族,其编码产物脆性X相关蛋白1(Fragile X related protein 1,FXR1P)与FMRP高度同源、生物学功能相似。FXR1P是RNA结合蛋白,可与靶mRNA和蛋白质相互作用,在机体各组织中发挥重要功能。双特异性磷酸酶6(Dual specificity phosphatase 6,Dusp6)是本课题组前期研究发现的、FXR1P的靶基因,但两者之间具体调控机制并不清楚。因此,本课题研究FXR1P与DUSP6在人神经母细胞瘤细胞中的相互作用关系,鉴定DUSP6介导的调控通路及生物学效应,为揭示FXR1在神经细胞中的功能提供实验依据。方法:(1)String数据库预测FXR1P与DUSP6的互作蛋白;(2)脂质体转染pEGFP-N1-FXR1与pDsRed2-N1-Dusp6到SK-N-SH细胞中,倒置荧光显微镜和激光共聚焦显微镜下观察DUSP6和FXR1P在细胞内的表达及定位;(3)基因重组技术构建含有标签的重组蛋白载体pCMV-Flag-Dusp6与pCMV-HA-FXR1,免疫共沉淀检测DUSP6和FXR1P的蛋白互作。(4)BioGRID、Hitpredict、Genemania、inBio Map、Int Act与String数据库预测DUSP6的靶基因,OMIM数据库分析其功能,确定DUSP6的候选靶基因;(5)构建Dusp6高表达载体,将其转染SK-N-SH细胞后,qRT-PCR检测DUSP6和FXR1P对DUSP6候选靶基因转录的调控作用;(6)Western blot检测DUSP6和FXR1P对候选靶基因翻译的调控作用;(7)CCK8法检测DUSP6对SK-N-SH细胞增殖的影响;(8)流式细胞术、姬姆萨和Hoechst33342染色法检测DUSP6对SK-N-SH细胞凋亡的影响。(9)使用SPSS19.0软件对所有数据进行统计分析。结果:1.FXR1P和DUSP6相互作用关系的鉴定:生物信息学预测显示FXR1P与DUSP6可能通过有丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase 3,MAPK3)存在相互作用。当GFP-FXR1P融合蛋白表达质粒和DsRed2-DUSP6融合蛋白表达质粒分别转染SK-N-SH细胞后,在胞质和胞核的相同位置可见绿红荧光叠加成黄色荧光。PCR扩增大小约为1.1kb的Dusp6和1.9kb的FXR1基因,分别克隆至真核表达载体pCMV-Flag和pCMV-HA后,经DNA测序鉴定显示重组载体pCMV-Flag-Dusp6与pCMV-HA-FXR1构建成功。将带有HA标签的FXR1P-HA融合蛋白表达质粒和带有Flag标签的DUSP6-Flag融合表达质粒共转染SK-N-SH细胞后,分别在anti-HA和anti-Flag沉淀的蛋白质混合物中均能检测到FXR1P-HA和DUSP6-Flag融合蛋白的存在。2.FXR1P-DUSP6介导的信号通路研究:通过生物信息学预测及功能分析筛选出MAPK1/3(也称为ERK1/2)、磷脂酰肌醇3激酶(Phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K)、酪氨酸激酶(Tyrosine kinase,TRKA)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin,mTOR)、富含丝氨酸/精氨酸的蛋白特异性激酶1(Serine/arginine-rich protein-specific kinase 1,SRPK1)和睾丸相关表达基因11(Testis expressed11,TEX11)作为Dusp6的候选靶基因。PCR扩增大小约为1.1kb的Dusp6基因,克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)后,经DNA测序鉴定显示真核表达载体pcDNA3.1(+)-Dusp6构建成功。分别单、共转染pcDNA3.1(+)-Dusp6和pcDNA3.1(-)-FXR1重组载体到SK-N-SH细胞后,qRT-PCR检测Dusp6候选靶mRNA的表达,结果显示相对于转染空质粒的对照组,转染pcDNA3.1(+)-Dusp6后,Dusp6 mRNA表达水平明显升高(P<0.001),ERK1、ERK2、TRKA、SRPK1和TEX11的mRNA表达水平下降(P<0.05),而PI3K和mTOR mRNA表达水平没有明显改变(P>0.05);转染pcDNA3.1(-)-FXR1后,FXR1、ERK1/2、PI3K和TRKA的mRNA表达水平上升(P<0.05),而mTOR mRNA表达水平没有明显改变(P>0.05);共转染pcDNA3.1(+)-Dusp6和pcDNA3.1(-)-FXR1后,PI3K与mTOR mRNA表达水平明显下降(P<0.01),而ERK1/2和TRKA mRNA表达水平没有明显改变(P>0.05)。Western blot检测显示当DUSP6表达增加时,不但ERK1/2蛋白表达降低(P<0.05),而且p-ERK1/2蛋白表达也降低(P<0.01);当FXR1P表达增加时,ERK1/2蛋白和p-ERK1/2蛋白表达也增加(P<0.05);当FXR1P和DUSP6表达同时增加时,ERK1/2蛋白和p-ERK1/2蛋白表达无明显变化(P>0.05)。3.DUSP6对SK-N-SH细胞增殖与凋亡的影响:转染pcDNA3.1(+)-Dusp6到SK-N-SH细胞后,CCK8结果显示在转染后48和72h时,细胞增殖抑制明显(P<0.01);流式细胞术、姬姆萨以及Hoechst染色结果显示转染后48h促进了细胞凋亡(P<0.05)。结论:1.FXR1P与DUSP6在SK-N-SH细胞中存在相互作用,两者共定位在细胞的胞质和胞核中。2.FXR1P通过与DUSP6相互作用调控SK-N-SH细胞中MAPK和AKT/mTOR细胞信号转导途径。3.DUSP6可抑制SK-N-SH细胞增殖,促进其凋亡,而FXR1P可能在一定程度上逆转SK-N-SH细胞中DUSP6对ERK1/2的负向调控作用。