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目的:(1)评价抗Thy1.1抗体制备大鼠系膜增生性肾小球肾炎(MsPGN)模型的可靠性。(2)研究MsPGN模型大鼠外周血Th17、Treg及炎症因子的演变特征。(3)初步探索外周血间充质干细胞(PB-MSCs)尾静脉移植治疗MsPGN的可行性。方法:(1)大鼠PB-MSCs的分离培养与鉴定:SD大鼠予粒细胞集落刺激因子(G-CSF,100μg/kg,每日一次)腹腔注射,连用5 d后采用大鼠淋巴细胞分离液(Ficoll)密度梯度离心收集外周血中的单个核细胞(PB-MNCs),进行接种培养;取P2代细胞,采用流式细胞术(FCM)对培养的PB-MSCs进行CD29、CD90、CD44h、CD45、CD11b和CD79a表面标志物分子鉴定。(2)大鼠MsPGN模型的制备及可靠性评价:清洁级SD雄性大鼠36只(6-8 w;180-220 g),单次尾静脉注射1.29 mg/kg Anti-Rat CD90(Thy1.1)诱导MsPGN模型。分别于3 d、7 d、14 d随机选取6只大鼠(共18只),切取肾脏组织制备石蜡切片,进行HE和PAS染色,α-SMA免疫组化标记系膜细胞增生;收集各时间点的大鼠24 h尿液测定24 h尿蛋白;外周血检测尿素与肌酐含量,籍以系统评价该模型制备方法的可靠性。(3)MsPGN模型大鼠外周血Th17、Treg及炎症因子的演变特征研究:流式细胞术(FCM)检测相应时间点的模型大鼠外周血Th17(CD4+IL-17A)、Treg(CD4+CD25+Foxp3+)细胞的动态变化;ELISA检测外周血IL-17A、IL-6、IL-10、TGF-β1炎症因子的动态变化;RT-qPCR检测肾脏病理组织IL-17A、IL-6、IL-10、TGF-β1、RORγT和Foxp3的表达变化;免疫组织化学(IHC)检测肾皮质区IL-17A、Foxp3的表达情况。(4)PB-MSCs经尾静脉移植治疗MsPGN的可行性探索:采用上述方法制备的大鼠MsPGN模型18只,于建模后24 h通过尾静脉移植PB-MSCs(P3代,2×10~6个细胞/只),分别在移植后第2 d、6 d、13 d(相当于建模后第3 d、7 d、14 d)随机选取6只大鼠进行取材,采用相同的实验方法对干细胞移植组大鼠肾脏组织及外周血进行如上相同指标检测分析。结果:(1)分离富集的PB-MSCs形态均一,呈梭形贴壁生长,高表达CD29、CD90、CD44h,不表达CD45、CD79a、CD11b。(2)肾组织病理特征:HE、PAS染色结果显示,与正常组相比,MsPGN模型大鼠肾皮质部分的肾小球系膜区均出现系膜细胞的增生及系膜基质增多,7 d达峰;PB-MSCs移植组肾小球系膜区系膜细胞的增生和系膜基质增多与模型组相比无明显差异。α-SMA免疫组化标记证实了系膜细胞的增生,PB-MSCs移植组与模型组相比较差异无统计学意义。(3)24 h尿蛋白定量、血肌酐与尿素结果显示:与正常组相比较,MsPGN模型大鼠3个时间点的24 h尿蛋白和血尿素含量均高于正常组(P<0.05),3 d达峰,血肌酐变化差异无统计学意义(P>0.05);PB-MSCs移植组24 h尿蛋白、血尿素及肌酐结果与模型组相比较差异无统计学意义(P>0.05)。(4)FCM结果显示:与正常组相比,MsPGN模型大鼠在3个时间点的Th17细胞均升高,3 d达峰,而Treg细胞在3个时间点均低于正常,但整体变化呈升高趋势(P<0.05);PB-MSCs移植组Th17、Treg细胞的结果与模型组相比较差异无统计学意义(P>0.05)。(5)ELISA结果显示:MsPGN模型组IL-17A、IL-6、TGF-β1在3个时间点的表达量均高于正常组(P<0.05),IL-17A在3 d达峰,IL-6在7 d达峰,IL-10、TGF-β1则为逐渐升高趋势(P<0.05);PB-MSCs移植组IL-17A、IL-6、IL-10、TGF-β1炎症因子结果与模型组相比较差异无统计学意义(P>0.05)。(6)RT-qPCR结果显示:MsPGN模型组IL-17A、IL-6、IL-10、TGF-β1和RORγT在3个时间点的m RNA表达均高于正常组(P<0.05),IL-17A和RORγT在3 d达峰,IL-6在7 d达峰,IL-10、TGF-β1则为逐渐升高趋势(P<0.05),Foxp3在3 d较正常组降低后升高,7 d达峰(P<0.05);移植组IL-17A、IL-6、IL-10、TGF-β1、RORγT和Foxp3 m RNA表达与模型组相比较差异无统计学意义(P>0.05)。(7)IHC结果显示:MsPGN模型组在肾皮质部分的肾小球系膜区IL-17A明显升高,3 d达峰(P<0.05),Foxp3在3 d较正常组降低后升高,7 d达峰(P<0.05);PB-MSCs移植组IL-17A、Foxp3的表达量与模型组相比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:(1)抗Thy1.1抗体制备的大鼠MsPGN模型,在疾病初期Th17及其相关因子IL-17A、IL-6和RORγT明显升高,而随着疾病发展,Treg及其相关因子IL-10、TGF-β和Foxp3逐渐升高,这些变化可能是MsPGN免疫失调的重要致病机制。(2)采用尾静脉移植PB-MSCs治疗MsPGN模型大鼠效果不显著,有待进一步研究。