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系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)患者神经系统受累被称为神经精神狼疮(Neuropsychiatric SLE,NPSLE),其中的脑受累称为狼疮脑病,是SLE预后不良的关键因素之一。至今为止,狼疮脑病病因尚不明确,临床治疗效果有限。因此,探究狼疮脑病的发病机制,寻找有效的靶向治疗方法是目前风湿免疫专业研究面临的一项重要课题。小胶质细胞是中枢神经系统固有的巨噬细胞,活化的小胶质细胞通过分泌炎性细胞因子、神经毒性因子等加重神经炎症反应,在多种神经炎症性疾病和神经退行性疾病中发挥重要致病作用。补体、细胞因子以及抗原-抗体免疫复合物等炎症介质与狼疮脑病的发病密切相关,而其具体机制尚不清楚。现有研究大多只关注炎症介质对脑血管内皮细胞和神经元的影响,尚未关注小胶质细胞在狼疮脑病发病过程中的作用。因此,本研究通过体外实验探讨了SLE患者外周血清中自身抗体、细胞因子等炎症介质能否导致小胶质细胞活化,从而揭示小胶质细胞在狼疮脑病发病中的作用机制。此外,鉴于小鼠BV2细胞生理功能和病理特性与小鼠原代小胶质细胞高度相似,本研究采用小鼠BV2细胞作为小胶质细胞体外研究对象。具体的研究内容分为以下几部分:第一部分:SLE患者血清对BV2细胞的活化作用目的:明确SLE患者血清对BV2小胶质细胞的活化作用。方法:以5%的SLE患者(SLE)血清或健康对照者(HC)血清分别刺激BV2小胶质细胞,MTT检测BV2细胞的细胞活性,western blot检测II型主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)分子、白细胞分化抗原(cluster of differentiation,CD)86、诱导性一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,i NOS)蛋白表达,Griess实验检测细胞培养上清一氧化氮(nitric oxide,NO)水平,ELISA检测细胞培养上清中促炎性细胞因子白细胞介素(Interleukin,IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor,TNF)-α和抑炎性细胞因子IL-4、IL-10的表达水平。结果:1、5%SLE血清对BV2细胞不具有细胞毒性。2、SLE血清可以引起BV2细胞“阿米巴样”形态学活化。3、SLE血清上调BV2细胞的MHC II、CD86蛋白表达。4、SLE血清上调BV2细胞i NOS蛋白表达和NO生成。5、SLE血清刺激BV2细胞分泌促炎性细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α,但不影响其分泌IL-4和IL-10。结论:SLE血清可以诱导BV2小胶质细胞炎性活化,提示小胶质细胞可能在SLE中枢神经系统炎症反应中发挥重要作用。第二部分:明确SLE患者血清激活BV2细胞的有效成分目的:探究SLE血清中的补体、IL-6、TNF-α和免疫球蛋白G型免疫复合物(Immunoglobulin G-immune complex,Ig G-IC)对BV2小胶质细胞活化的影响,以明确SLE血清中活化BV2小胶质细胞的核心成分。方法:(一)SLE血清中补体、细胞因子对BV2细胞的活化作用:1、SLE血清的处理:a.加热灭活血清中的补体;b.中和抗体封闭血清中的TNF-α;c.中和抗体封闭血清中的IL-6;2、将经过以上处理的SLE血清和未处理SLE血清分别刺激BV2细胞,检测MHC II、CD86、i NOS蛋白表达、NO合成和IL-1β、IL-6、TNF-α分泌水平的差异。(二)SLE血清Ig G-IC对BV2细胞的活化作用:1、实验分组:利用Protein G亲和层析分别将SLE和HC血清分成Ig G-IC(+)和Ig G IC(-)两组。a.HC Ig G-IC(+):HC血清Ig G-IC;b.HC Ig G-IC(-):去除Ig G-IC的HC血清;c.SLE Ig G-IC(+):SLE血清IgG-IC;d.SLE Ig G-IC(-):去除Ig G-IC的SLE血清;2、将以上血清成分分别刺激BV2细胞,检测MHC II、CD86、i NOS蛋白表达、NO合成和IL-1β、IL-6、TNF-α分泌水平的差异。3、免疫荧光观察SLE Ig G能否与BV2小胶质细胞结合,以明确BV2细胞对SLE血清的作用方式。结果:(一)去除SLE血清中的补体、TNF-α和IL-6对BV2细胞的活化无明显影响。(二)SLE血清对BV2细胞的活化作用依赖于Ig G-IC:1、在HC Ig G-IC(+)、HC IgG-IC(-)、SLE Ig G-IC(+)和SLE Ig G-IC(-)四组中,只有SLE Ig G-IC(+)组的BV2细胞表现出MHC II、CD86、i NOS蛋白表达上调,NO合成增加,IL-1β、IL-6、TNF-α分泌增多。2、免疫荧光检测显示SLE Ig G-IC(+)可以与BV2细胞膜结合,HC Ig G-IC(+)不能与BV2细胞膜结合。结论:SLE血清对BV2小胶质细胞的活化作用依赖于Ig G-IC,而不是补体或细胞因子。第三部分:SLE患者血清Ig G-IC激活BV2细胞的信号转导机制目的:探讨SLE血清Ig G-IC激活BV2小胶质细胞的信号转导机制。方法:1、SLE和HC Ig G-IC分别刺激BV2细胞,western blot检测Toll样受体(Toll like receptor,TLR)9蛋白、IκBα和核因子kappa B(nuclear factor kappa B,NF-κB)p65总蛋白及其磷酸化蛋白的表达水平,明确SLE Ig G-IC是否通过TLR9/NF-κB信号通路激活BV2细胞。2、小干扰RNA(small interfering RNA,si RNA)沉默BV2细胞TLR9表达后,检测其对SLE Ig G-IC诱导的NF-κB信号通路和BV2细胞活化的影响。我们通过NO合成和炎性细胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)分泌评价BV2细胞的活化水平。结果:1、SLE Ig G-IC促进BV2小胶质细胞TLR9蛋白表达升高、IκBα蛋白降解、IκBα磷酸化和p65磷酸化水平升高。2、应用TLR9 si RNA可以有效降低SLE Ig G-IC诱导的NF-κB信号通路活化、NO生成和细胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)分泌。结论:SLE血清Ig G-IC可以通过激活TLR9/NF-κB信号通路,诱导BV2小胶质细胞炎性活化。