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【目的】从全球范围来看,结核病仍是严重危害人类健康的致死性传染病。耐药、耐多药结核病的广泛存在使结核病的治疗面临重大挑战。而结核病程中由于过度炎症反应导致的病理损伤也是结核病防治中有待改善的一个重要方面。我国拥有丰富的中草药资源,研究证实许多中药具有调控机体固有免疫的作用。穿心莲内酯是穿心莲的主要有效成分,具有良好的抗炎活性。本研究利用结核分枝杆菌感染巨噬细胞及其与肺上皮细胞共培养的模型评价穿心莲内酯对巨噬细胞和肺上皮细胞炎症反应的调控作用并探究其分子机制,为穿心莲内酯作为控制结核病病程中过度炎症反应的候选药物提供理论基础和实验依据。【方法】(1)利用ELISA法检测穿心莲内酯对结核分枝杆菌感染后的人单核细胞THP-1分泌炎性细胞因子的影响;(2)利用免疫共沉淀、Western blot及免疫荧光检测方法观察穿心莲内酯对结核分枝杆菌感染的THP-1细胞和原代小鼠腹腔巨噬细胞中NLRP3炎症小体活化的影响;(3)利用Western blot法检测穿心莲内酯对结核分枝杆菌感染巨噬细胞自噬的促进作用;(4)利用平板菌落计数法评价穿心莲内酯对巨噬细胞内结核分枝杆菌的杀伤作用;(5)利用Western blot、免疫荧光等方法检测穿心莲内酯促进巨噬细胞自噬情况以及自噬对NLRP3炎症小体的调控。检测PI3K/Akt和MAPK等自噬相关通路及NF-κB信号通路的活化情况;(6)建立巨噬细胞和肺上皮细胞的共培养模型,利用real-time PCR研究结核分枝杆菌感染后巨噬细胞和肺上皮细胞相互作用,观察上皮细胞中趋化因子和金属基质蛋白酶基因的表达情况,并对穿心莲内酯在共培养体系中的免疫调控作用进行研究;(7)在结核分枝杆菌感染巨噬细胞和肺上皮细胞共培养体系中利用IL-1β的中和性抗体阻断IL-1β的作用来探讨穿心莲内酯可能作用机制。【结果】(1)ELISA结果显示,穿心莲内酯显著降低结核分枝杆菌感染的巨噬细胞上清中IL-1β,IL-6和TNF-α的表达;(2)Western blot法检测NLRP3炎症小体活化情况的结果显示,穿心莲内酯显著抑制THP-1细胞和原代小鼠腹腔巨噬细胞内NLRP3、pro-IL-1β及上清中caspase-1p20、IL-1β蛋白的表达。免疫共沉淀结果也证明穿心莲内酯抑制ASC和NLRP3蛋白之间的相互作用;(3)Western blot检测细胞自噬情况的结果显示,穿心莲内酯呈浓度梯度依赖性地上调细胞内LC3Ⅱ蛋白,同时降低p62蛋白表达,说明穿心莲内酯促进巨噬细胞自噬的发生;(4)平板菌落计数法的结果显示,穿心莲内酯显著降低巨噬细胞内结核分枝杆菌的存活;(5)免疫荧光结果显示穿心莲内酯能促进自噬小体和炎症小体的共定位;(6)Western blot结果显示,穿心莲内酯显著抑制Akt、m TOR和NF-κB p65的磷酸化;(7)巨噬细胞和肺上皮细胞的共培养模型中,结核分枝杆菌感染后,肺上皮细胞的趋化因子及金属基质蛋白酶(MMP)基因水平显著上升,穿心莲内酯对这种上升有显著的抑制作用;(8)在结核分枝杆菌感染巨噬细胞和肺上皮细胞共培养体系中IL-1β的中和性抗体可以抑制肺上皮细胞的趋化因子及金属基质蛋白酶(MMP)基因表达,表明肺上皮细胞炎症反应部分依赖巨噬细胞分泌的IL-1β来实现的。【结论】穿心莲内酯能调控结核分枝杆菌感染巨噬细胞的炎症反应,抑制IL-1β等细胞因子的分泌,而下调的IL-1β使共培养的肺上皮细胞中趋化因子和MMP基因表达水平下降,间接抑制肺上皮细胞的炎症反应。穿心莲内酯发挥炎症调控作用的具体分子机制是通过抑制巨噬细胞中PI3K/Akt/m TOR信号通路和NF-κB信号通路来实现的。穿心莲内酯可以通过调控结核分枝杆菌引起的过度炎症反应来减少结核病程中的组织损伤,有望成为结核病辅助治疗的候选药物。