论文部分内容阅读
棉花是世界上重要的经济作物,黄萎病严重危害棉花产量和纤维品质,寻找抗黄萎病基因,明确基因功能,深入解析棉花抗黄萎病的分子机制是棉花抗病育种中亟需解决的重要科学问题。高质量版本的基因组是提升基因家族分析准确性的必要条件。本研究以目前最新的陆地棉TM-1高质量版本基因组为参考,通过生物信息学分析鉴定了陆地棉基因组中的Laccase（LAC）基因家族,并对其进行了理化性质、基因结构、染色体定位以及在黄萎病胁迫下的表达模式分析。结合抗病转录组数据和全长cDNA文库筛选以及功能尚未报道的前提,挑选出4个与拟南芥直系同源的新基因,分别命名为GhLAC4,GhLAC7,GhLAC11和GhLAC12。为明确候选基因抗黄萎病功能及分子机制,本研究进一步从基因表达、VIGS基因功能方面研究了四个候选基因的功能。主要研究结果如下:1.陆地棉TM-1基因组鉴定到83个LAC家族成员,分布在24条染色体上,所有LAC蛋白均定位在胞外,且具有相同/相似的保守基序。系统发育树分析显示LAC基因家族成员可分为7个亚组。生物信息学分析GhLAC4,GhLAC7,GhLAC11和GhLAC12分别编码558、564、563、510个氨基酸残基蛋白,GhLAC4,GhLAC7和GhLAC11分别含有一个信号肽,GhLAC12没有信号肽,GhLAC11具有一个跨膜域,其他三个基因无跨膜域。亚细胞定位结果显示,四个漆酶基因编码蛋白都定位在细胞外。2.基于黄萎病胁迫下抗病陆地棉农大601的转录组数据,将LAC基因家族各成员的表达分为3种模式,第1类基因呈现出病原菌诱导后表达上调,包括GhLAC79、GhLAC80、GhLAC43等24个成员;第2类基因受病原菌胁迫后呈现不同程度下调表达,包括GhLAC07、GhLAC40、GhLAC45、GhLAC72等56个成员,接菌后这些基因的表达明显受到抑制,暗示这些基因在棉花抗黄萎病反应中起负调控作用;第3类基因不响应黄萎病菌处理,推测其不参与棉花抗黄萎病过程,包括GhLAC11、GhLAC27和GhLAC49。3.进一步利用实时荧光定量PCR鉴定了4个漆酶基因受黄萎病菌诱导后的表达,发现GhLAC4,GhLAC11和GhLAC12受黄萎病菌诱导表达上调,与转录组表达趋势一致,GhLAC7受黄萎病菌抑制表达。组织特异表达结果显示4个基因在根、茎、叶中均表达;GhLAC4在茎中表达量最高,在根中表达量次之;GhLAC7,GhLAC11和GhLAC12在根中表达量最高,茎中次之,叶中表达量均最低。4.启动子元件分析表明GhLAC4基因含有响应茉莉酸甲酯（JA）和水杨酸（SA）的顺式作用元件,GhLAC11含有响应SA的顺式作用元件;棉苗叶面喷施SA或JA,基因表达结果表明GhLAC4响应SA和JA信号;GhLAC11仅响应SA信号诱导。5.从抗病农大601中克隆GhLAC4,GhLAC7,GhLAC11和GhLAC12目的片段,长度为340 bp左右,构建VIGS载体。接黄萎病菌25d后,四个基因的沉默棉株病指低于对照,抗病性增强,沉默棉株的H2O2,SOD和NO含量高于对照;沉默棉株的POD活力低于对照。6.接菌25d的沉默棉株和对照棉株的木质素原位染色与测定结果显示,沉默棉株木质素染色均变浅,说明漆酶基因沉默后木质素积累降低;溴乙酰法进一步测定木质素含量表明,沉默棉株GhLAC4,GhLAC7,GhLAC11和GhLAC12木质素百分含量分别为15.34%、7.58%、14.78%、23.22%,对照棉株木质素百分含量为33.31%。7.利用qRT-PCR分析沉默植株苯丙烷途径木质素合成途径及其旁支黄酮类化合物和棉酚合成路径基因的转录变化,发现沉默植株木质素合成途径基因PAL,4CL,COMT,HCT,CCoAOMT和CAD的表达水平均高于对照,表明较低的木质素含量对木质素途径合成酶基因的转录水平呈负反馈;黄酮类化合物和棉酚合成相关基因CHS,CHI,DFR,F3H,F3’H,LAR,ANR和TBS表达水平高于对照。综上,本研究鉴定了陆地棉83个GhLAC成员,明确了黄萎病菌诱导下各成员的表达规律;明确了GhLAC4,GhLAC7,GhLAC11和GhLAC12四个基因的功能;初步探明了四个成员的抗黄萎病机制。