目前,人口老龄化为我国极为严峻的社会问题,严重影响社会、经济等各方面发展。伴随社会老龄化问题日益严峻,老年神经退行性疾病和临床各种原因导致的呼吸衰竭、感染、休克甚至急性肺损伤和急性呼吸窘迫综合征病人急剧增多。研究重要脏器损伤保护及调控机制,开发可能调控靶点及保护性药物,成为亟待解决的临床问题。先天免疫是体内第一道防线,在清除外来病原体和产生适应性免疫反应方面起重要作用。NLRP3炎性体与生物性损伤和免疫疾病密切相关,其内在调节机制阐明和研发可能调控药物成为研究热点。研究重要脏器损伤保护及调控机制,开发可能调控靶点及保护性药物,为亟待解决的临床问题。帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是以多巴胺能神经元变性、缺失为病理特征的典型老年神经退行性疾病,主要表现为震颤,运动迟缓和僵硬。病理特点为黑质致密部多巴能(Dopamine,DA)能神经元进行和广泛变性、缺失,细胞内出现含a-突触核蛋白(a-synuclein)路易小体(Lewy body,LB)。羟红花黄色素 A(Hydroxysafflor yellow A,HYSA)是从传统中药红花(Carthamus tinctorius L.)中提取的葡萄糖苷类化合物。研究表明,HSYA具有活血化瘀、神经保护、抗氧化及脑和心肌缺血再灌注损伤等多种药用价值,且其在心脑血管及神经退行性疾病中作用成为研究热点。6-羟多巴胺(6-OHDA)局部纹状体注射鼠和6-OHDA诱导人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)损伤模型被广泛用于PD药物评价。己有报道HSYA明显改善6-OHDA诱导PD鼠运动障碍和行为学改变,然而在6-OHDA诱导的以黑质纹状体多巴胺合成限速酶酪氨酸羟化酶(Tyrosine Hydroxylase,TH)及多巴胺及代谢产物降低为特征的脑神经元损伤中,其对NLRP3炎性体和MAPK通路调控机制知之甚少。研究其内在分子机制,为临床提供潜在治疗靶点和可能治疗药物具有重要价值。本研究第一部分以6-OHDA诱导的鼠多巴胺能神经元和SH-SY5Y细胞损伤为研究对象,通过检测HSYA对NLRP3和MAPK信号通路影响探讨HSYA作用机制,为HSYA作为传统中药红花提取物在脑损伤保护中的开发利用提供理论和实验依据。研究发现,在6-OHDA诱导的脑损伤纹状体中观察到NLRP3活化与多巴胺神经元损伤密切相关,提示多巴胺神经元和NLRP3炎性体可相互调节。既往临床研究发现,NLRP3促进炎症反应破坏多巴胺神经元。多巴胺能神经元可抑制NLRP3活化,据此得到启发,脑内多巴能神经递质的增多调控NLRP3炎性体活化。NLRP3炎性体在6-OHDA诱导脑损伤发生及进展中起重要作用,提示内源性多巴胺神经递质在调控炎性小体中发挥作用。多巴胺(DA)作为一种神经递质,不仅可调节行为,内分泌,运动,心血管,胃肠和肾脏功能,也是连接神经和免疫系统的重要纽带,DA受体几乎存在于所有免疫细胞亚群中,可调节激活免疫细胞增殖和细胞因子产生。既往研究证实,机械通气(mechanical ventilation,MV)诱导肺损伤中,肺泡巨噬细胞(Alveolarmacrophages,AMs)是肺部细胞因子主要来源和重要靶细胞,AMs约占肺泡腔外周细胞数5%左右,占生理条件肺泡白细胞总数的95%,在固有免疫防御中发挥作用。机械牵张可激活AMs,产生大量趋化和细胞因子,炎症因子募集单核、中性粒、巨噬细胞和淋巴细胞,引发严重肺部炎性反应及生物性损伤。既往研究主要集中在多巴胺在中枢神经系统发挥调节炎症和固有免疫作用,然而其在NLRP3介导的肺生物性损伤中调控机制尚未完全阐明。本研究第二部分以机械牵张的鼠和环形牵张(cyclic stretch,CS)的肺泡巨噬细胞(AMs)为研究对象,探讨多巴胺调控NLRP3炎性体通路分子机制,寻找肺生物损伤有效治疗靶点和调控机制,具有重要社会意义和经济价值。第一部分:羟基红花黄色素A(HSYA)调控NLRP3和MAPK通路对6-OHDA诱导的脑损伤作用机制研究目的1.探讨HSYA对6-OHDA诱导多巴胺能神经元损伤的保护作用及机制。2.检测HSYA对PD模型小鼠NLRP3和MAPK信号通路蛋白表达影响。3.探讨HSYA对6-OHDA诱导SH-SY5Y细胞NLRP3和MAPK通路相关蛋白表达的影响。方法1.体内(动物)实验部分1.1 PD鼠模型建立立体定位仪下右侧纹状体注射6-OHDA。1.2分组实验选取C57BL/6J小鼠80只,随机分为5组:①假手术组(Sham组),②6-OHDA 模型组(6-OHDA 组),③6-OHDA+HSYA(2mg/kg)组,④6-OHDA+HSYA(4mg/kg)组,⑤6-OHDA+HSYA(8mg/kg)组,每组 l 6只。1.3行为学检测模型组及药物治疗组小鼠纹状体注射6-OHDA后15min腹腔注射不同浓度HSYA或生理盐水,每天一次连续两周,Sham组纹状体注射生理盐水(含0.2%抗坏血酸)作为对照,两周后观察阿扑吗啡(Apomorphine,APO)诱导的小鼠对侧旋转行为。1.4高效液相色谱检测鼠脑内多巴胺(DA)及代谢产物二羟基苯乙酸(DOPAC)和高香草酸(HVC)含量通过高效液相色谱检测纹状体DA、DOPAC、HVA含量,从而探讨HSYA对PD小鼠纹状体多巴胺及代谢产物影响。1.5多巴胺能神经元损伤检测免疫组化及Western blot检测多巴胺神经递质合成限速酶酪氨酸羟化酶(Tyrosine Hydroxylase,TH)蛋白表达量及观察黑质多巴胺神经元数量。1.6免疫蛋白印迹(Western blot)收集脑组织,蛋白印迹检测NLRP3和MAPK信号通路相关蛋白NLRP3,COX-2,iNOS,NF-κB p-p65,NF-κB p65,IκBα,p-ERK,ERK,p-JNK,JNK,p-p38,p38 表达。2.体外(细胞)实验部分2.1 6-OHDA细胞损伤模型建立及分组实验分组①对照组(normal组);②6-OHDA模型组(6-OHDA组);③6-OHDA+HSYA(l×l0-6 mol/L)组;④6-OHDA+HSYA(5×l0-6 rnol/L)组;⑤6-OHDA+HSYA(10-5 mol/L)组。生理盐水或不同浓度HSYA处理人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)2h,将其暴露在 6-OHDA(50pM)24h。2.2检测指标2.2.1 CCK-8法检测SH-SY5Y细胞活性。2.2.2 收集细胞蛋白,Western blot 检测 p-ERK、ERK、p-p38、p38、p-JNK、JNK和NLRP3蛋白水平2.2.3收集细胞上清,ELISA检测IL-lβ和IL-18蛋白水平。2.2.4 Western blot检测JNK磷酸化激动剂存在情况下iNOS,COX-2,NF-κB-p-65和IκBα蛋白表达水平。结果1.HSYA改善6-OHDA诱导的小鼠行为学改变模型组和药物治疗组C57BL/6J小鼠右侧纹状体注射6-OHDA后,分别给予NS,HSYA(2,4,8mg/kg)腹腔注射14天。APO皮下注射,测量30min时间内每10min平均旋转次数以评估鼠行为学改变。与Sham组比较,6-OHDA组APO诱导的对侧旋转显著增高(P<0.05);与6-OHDA组比较,6-OHDA+HSYA(8mg/kg)组小鼠APO诱导对侧旋转显著降低(P<0.05)。2.HSYA增加6-OHDA诱导的小鼠纹状体多巴胺含时高效液相色谱分析各组鼠纹状体多巴胺及其代谢产物含量。结果显示与Sham组比较,6-OHDA组小鼠纹状体DA含量明显降低(P<0.05);与6-OHDA组比较,HSYA(8mg/kg)+6-OHDA鼠纹状体内DA含量显著增加(P<0.05)。3.HSYA保护6-OHDA诱导的PD鼠黑质和纹状体多巴胺能神经元损伤通过免疫组化和蛋白检测多巴胺合成的限速酶酪氨酸羟化酶(TH),评估黑质(substantia nigra pars copmacta,SN)和纹状体(Striatum,STR)多巴胺能神经元损伤情况。体内实验中,免疫组化染色结果显示,SN中TH 阳性神经元和STR中TH 阳性区域在Sham组中,很容易观察到。在6-OHDA组中,SN中TH阳性神经元和STR中TH 阳性区域显著降低(P<0.05)。6-OHDA+HSYA(8mg/kg)组与6-OHDA组相比,SN中TH 阳性神经元数目和STR中TH 阳性突触密度显著升高(P<0.05)。Western blot测定TH蛋白表达,与Sham组相比,6-OHDA损伤显著降低SN 和 STR 中 TH 蛋白表达(P<0.05),与 6-OHDA 组相比,6-OHDA+HSYA(8mg/kg)显著增加TH表达(P<0.05)。4.HSYA降低6-OHDA诱导的NLRP3炎性体蛋白表达体内实验,Western blot显示,与Sham组比,6-OHDA组NLRP3炎性体表达水平显著升高,HSYA剂量依赖性降低NLRP3表达,与6-OHDA组相比,6-OHDA+HSYA(8mg/kg)组NLRP3 显著降低(P<0.05)。体外实验,Western blot显示,与normal组相比,6-OHDA组NLRP3蛋白显著升高,与6-OHDA组相比,6-OHDA+HSYA(10-5mol/L)组NLRP3表达显著降低(P<0.05)。ELISA检测NLRP3下游炎性因子IL-1β和IL-18的表达,结果显示,与normal组相比,6-OHDA组细胞上清IL-1β和IL-18含量显著升高(P<0.05),HSYA剂量依赖性降低IL-1β和IL-18含量。5.HSYA 调控 iNOS,COX-2 和 NF-κB p-p65 和 IKBα 蛋白表达Western blot 结果示,与 Sham 组相比,6-OHDA 组 iNOS,COX-2 和 NF-κB p-p65 显著升高(P<0.05),HSYA 剂量依赖性降低 iNOS,COX-2 和 NF-κB p-p65表达水平,与6-OHDA组相比,HSYA(8mg/kg)显著提高IκBα表达水平(P<0.05)。以上结果表明,HSYA降低炎性相关iNOS,COX-2表达及NF-κB的活化。6.HSYA改善6-OHDA诱导SH-SY5Y细胞活性改变CCK-8试剂盒检测HSYA存在情况下6-OHDA对SH-SY5Y细胞活性影响,结果示与normal组相比6-OHDA组细胞活性显著降低(P<0.05),6-OHDA+HSYA(5×10-6和10-5 mol/L)与6-OHDA组相比细胞活性显著提高(P<0.05)。7.HSYA调控MAPK通路相关蛋白表达体内实验中,Western blot结果示,与Sham组比6-OHDA显著降低p-ERK并增加p-JNK和p-p38蛋白水平(P<0.05),与6-OHDA组比,HSYA剂量依赖性升高p-ERK而降低p-JNK和p-p38蛋白水平。体外实验Western blot结果示,与Normal组比6-OHDA显著降低p-ERK并增加p-JNK和p-p38蛋白水平。与6-OHDA 组相比,HSYA(10-5mol/L)显著提高 p-ERK 并降低 p-JNK 和 p-p38水平(P<0.05)。8.HSYA 调控 SH-SY5Y 细胞中 iNOS,COX-2 和 NF-κB p-p65/IKBα 表达水平依赖于JNK磷酸化体外实验,Western blot 检测 iNOS,COX-2,NF-κB p-p65,NF-κB p65,IκBα蛋白水平。与 6-OHDA 组相比,HSYA(l0-5 mol/L)降低 iNOS,COX-2 和 NF-κB p-p65表达水平,显著升高IκBα蛋白表达(P<0.05),JNK磷酸化激动剂茴香霉素可部分逆转HSYA降低iNOS,COX-2和NF-KB p-p65的作用,表明HSYA调控炎症发挥神经保护作用可能依赖于JNK磷酸化。结论1.HSYA对6-OHDA诱导的黑质纹状体多巴胺能神经元损伤具有保护作用。2.HSYA调控6-OHDA诱导的鼠多巴胺能神经元及SH-SY5Y细胞损伤NLRP3和p38-MAPK信号通路相关蛋白表达。第二部分:多巴胺调控NLRP3通路对机械牵张诱导肺生物伤的保护作用及机制研究目的1.明确多巴胺是否在肺生物损伤中抑制NLRP3炎性体及下游细胞因子表达。2.明确环形牵张能否诱导肺泡巨噬细胞NLRP3炎性体活化。3.阐明多巴胺能否通过调控NLRP3炎性体,对环形牵张肺泡巨噬细胞起保护作用。方法本实验分为体内和体外两部分1.体内(动物)实验部分1.1动物分组与造模:成年雄性Wistar大鼠30只,实验随机分5组:对照组(Con);肺损伤组(HV);肺损伤+多巴胺(10mg/kg)组(HV+DA1);肺损伤+多巴胺(20mg/kg)组(HV+DA2);肺损伤+多巴胺(30mg/kg)组(HV+DA3),每组各6只。对照组小鼠,气管切开后,不进行机械通气,HV组和HV+DA组呼吸频率50次/min,潮气量30mL/kg,呼气末正压0cmH20;四组共用参数:吸呼比(I:E)l:2,吸入氧浓度为21%。小动物呼吸机通气4h,治疗组腹腔注射不同剂量多巴胺,HV组腹腔注射等量生理盐水。1.2光镜下观察肺组织病理学改变,病理半定量评分。1.3检测肺组织,湿干比(W/D)、髓过氧物酶(MPO)、肺泡灌洗液蛋白水平。1.4 ELISA检测肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-18蛋白水平。1.5 RT-qPCR检测肺组织IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-18细胞因子mRNA表达水平。1.6 Western-blot检测多巴胺对肺组织NLRP3、Caspase-1、IL-l β表达水平影响。2.体外(细胞)实验部分2.1研究多巴胺对环形牵张的肺泡巨噬细胞NLRP3活性的影响肺泡巨噬细胞(AMs),实验分组:对照组(Con);牵张组(CS),牵张+多巴胺(0.lmM)组(CS+DA1);牵张+多巴胺(0.2mM)组(CS+DA2);牵张+多巴胺(0.3mM)组(CS+DA3)。2.2肺泡巨噬细胞培养和环形牵张2.2.1分离AMs,培养含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基:种植密度1.0×102,培养皿预铺0.1%胶原蛋白IV,置于5%CO2.95%空气的孵育箱内培养(37℃,饱和湿度)。2.2.2将收集AMs种植6孔弹性底培养(BioFlex baseplate),BioFlex培养皿固定在FX-4000T Flexercell细胞环形牵张仪25-mm BioFlex承载台,牵张模拟机械通气(5%CO2.95%空气,37℃,饱和湿度)。设定牵张参数,频率0.5 Hz,牵张/松弛比1:1。培养皿底部牵张度20%,牵张4h。2.3各项指标的检测2.3.1 RT-qPCR 检测各组细胞 IL-lβ,IL-18 mRNA 表达量。2.3.2 Western blot 检测各组细胞 NLRP3,Caspase-1,IL-1β 蛋白表达。结果1.多巴胺减轻机械牵张引起的肺病理形态学改变模型组及药物治疗组机械通气4h,HV+DA组给予不同浓度多巴胺腹腔注射,收集肺组织HE染色,光镜下观察肺组织病理形态改变。结果显示,与Con组相比,HV组肺泡充血,水肿严重,肺泡壁增厚,透明膜形成,肺组织结构损伤明显,病理评分显著增高(P<0.05)。与HV组相比,HV+DA3组,肺泡充血,水肿,出血及病理结构损伤明显减轻,肺组织病理评分显著降低(P<0.05)。2.多巴胺降低肺组织湿/干重比(W/D)和髓过氧化物酶(MPO)活性收集肺组织,测定肺组织湿干比(W/D),与Con组相比,HV组W/D明显升高(P<0.05)。多巴胺(DA)浓度依赖性降低MV导致的肺组织W/D。MPO试剂盒检测MPO活性以评估多形核中性粒细胞浸润,中性粒细胞浸润在肺炎性损伤中发挥重要作用。结果示,与Con组比,HV组MPO活性显著增加(P<0.05),HV+DA3组MPO活性较HV组显著降低(P<0.05)。3.多巴胺降低肺泡灌洗液(BALF)蛋白浓度。肺泡灌洗液(BALF)中蛋白的浓度是评价肺损伤的重要指标,本实验收集BALF,BCA法检测蛋白浓度。结果示,与Con组相比,HV组BALF中蛋白浓度显著增加(P<0.05)。多巴胺剂量依赖性降低BALF中蛋白水平。4.多巴胺减轻机械牵张诱导的炎性细胞因子表达和释放。体内实验中,收集肺组织,实时定量PCR(RT-qPCR)检测细胞因子表达。HV组IL-1β,TNF-α,IL-6和IL-18的mRNA水平显著高于Con组(P<0.05)。HV+DA3组IL-lβ,TNF-α,IL-6和IL-18 mRNA表达水平较HV组显著降低(P<0.05)。ELISA检测BALF上清细胞因子浓度。与Con组相比,HV组IL-lβ,TNF-α,IL-6和IL-18明显增加(P<0.05)。与HV组相比,多巴胺剂量依赖性降低BALF中IL-lβ,TNF-α,IL-6和IL-18表达。体外实验中,牵张前lh给予不同剂量多巴胺,CS牵张AMs 4h,收集细胞,RT-qPCR检测 IL-1β,IL-18mRNA表达。结果显示CS增加IL-18,IL-lβ mRNA表达。多巴胺剂量依赖性降低AMs中IL-18,IL-1β mRNA表达。5.多巴胺抑制机械牵张诱导的NLRP3炎性体表达IL-lβ和IL-18的产生需要NLRP3炎性体的存在和激活。体内实验中,收集肺组织Western blot检测NLRP3,caspase-1和IL-1β蛋白表达。HV显著增加NLRP3,caspase-1和IL-1 β蛋白表达(P<0.05),多巴胺剂量依赖性抑制其表达并降低机械牵张诱导的IL-1β产生。体外实验中,牵张前lh给予不同剂量多巴胺,CS牵张AMs 4h,收集细胞,Western blot 结果显示,CS增加NLRP3,Caspase-1,及IL-1β表达。CS组NLRP3,Caspase-I,及IL-1β蛋白水平显著高于Con组(P<0.05),多巴胺剂量依赖性抑制CS诱导的NLRP3,Caspase-1,IL-1β蛋白表达。结论1.多巴胺对机械牵张诱发的肺生物性损伤有保护作用。2.多巴胺调控NLRP3炎性体信号通路及细胞因子IL-1β,IL-18释放。3.多巴胺剂量依赖性抑制环形牵张肺泡巨噬细胞NLRP3炎性体信号通路激活并降低细胞因子IL-lβ,IL-18表达。