目的：糖尿病是严重危害人类健康的慢性常见病，糖尿病易并发心血管疾病，其中糖尿病心肌病（Diabetic cardiomyopathy,DCM）已成为糖尿病病人致死的主要原因；然而，有关糖尿病心肌病的发病机制并不完全清楚。近年研究提示，内质网应激（Endoplasmic Reticulum stress,ER stress）可能参与促糖尿病心肌病形成。　　内质网是真核细胞重要的细胞器之一，其主要功能是促进蛋白质折叠，使之具有一定的立体构型，对蛋白质进行翻译后修饰；氧化应激、钙紊乱、糖缺乏等因素可引起未折叠和错折叠蛋白在内质网腔堆积，诱发内质网应激，包括早期的未折叠蛋白反应和后期的细胞凋亡反应。未折叠蛋白反应的主要作用是增加蛋白折叠能力，降低未折叠蛋白负荷，重建内质网的正常功能稳态；为了达到这一目的，未折叠蛋白反应通过1）上调内质网分子伴侣免疫球蛋白结合蛋白/葡萄糖调节蛋白78（immunoglobulin binding protein/glucose-regulated protein78,Bip/GRP78）等基因转录、表达，从而增加内质网的蛋白折叠能力，以减少蛋白质在内质网的堆积；2）磷酸化真核翻译起始因子2-α（eukaryocyte translation initiation factor2α,eIF2-α），从而抑制蛋白质的合成，以减少新生蛋白质进入内质网堆积；3）活化肌醇需求激酶1/核糖核酸内切酶（Inositol-requiring kinase-1/endoribonuclease,IRE-1）剪接X盒结合蛋白1（X box-binding protein-1,XBP-1）mRNA，并翻译成有活性的XBP-1蛋白，从而促进内质网相关性蛋白降解，以清除错误折叠的蛋白质；4）如果上述未折叠蛋白反应仍不能减少内质网中未折叠或错折叠蛋白的堆积，最终通过上调CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白（C/EBP homology protein,CHOP）表达等，诱导细胞凋亡反应。因此，可选用GRP78基因的转录或表达、eIF2-α的磷酸化、XBP-1mRNA的剪接以及促凋亡蛋白CHOP的表达等指标来评价内质网应激。　　氧化应激和钙紊乱不仅是诱导细胞内质网应激的重要因素，而且也在糖尿病心肌病的发生发展中起重要作用。我室和国内外学者大量研究表明，内源性一氧化氮合酶（nitric oxide synthase,NOS）抑制物非对称性二甲基精氨酸（NG,NG-asymmetric dimethylarginine,ADMA）为血管内皮功能不全的独立危险因子，不仅在动脉粥样硬化、高血压、充血性心力衰竭等心血管疾病的发生发展中起重要作用，也与糖尿病及其心血管并发症密切相关。内源性ADMA主要是由蛋白精氨酸甲基转移酶1（Protein arginine N-methyltransferase1,PRMT1）催化含精氨酸残基的蛋白质甲基化，然后再经蛋白水解作用将其释放而来；除了少部分经肾脏原形排泄以外，内源性ADMA大部分由广泛分布于各组织细胞的二甲基精氨酸二甲胺水解酶（Dimethylargininedimethylaminohydrolase,DDAH）代谢消除；因此，PRMT1和DDAH是调节内源性ADMA浓度的重要因子。ADMA作为内源性NOS抑制物，可竞争性抑制NOS活性，从而减少血管内皮细胞合成、释放内源性心血管保护分子一氧化氮（nitric oxide,NO）；还可使NOS解偶联，增加超氧阴离子等活性氧（Reactive oxygen species,ROS）的生成，导致氧化应激增加；抗氧化剂治疗不仅可明显降低心血管疾病和糖尿病的内源性ADMA浓度，也显著改善其血管内皮功能，提示内源性ADMA升高与氧化应激增加有关；最近我室研究发现，2型糖尿病大鼠血清中ADMA明显升高并与肝脏内质网应激密切相关，但尚无文献报道ADMA是否与心肌内质网应激有关。虽然目前尚缺乏ADMA与心功能障碍相关的直接证据，但有研究显示，心衰病人血浆ADMA水平与其心衰的严重程度呈正比；最近我室研究也发现，用ADMA孵育大鼠离体左心室乳头肌亦可抑制电刺激所致的心肌收缩力；这些结果提示ADMA对心肌收缩力具有抑制作用，并可能是通过对细胞钙稳态的潜在影响所致。　　依据氧化应激和钙紊乱是引起内质网应激的重要因素并在糖尿病心肌病形成中起重要作用；作为氧化应激标志物的ADMA在糖尿病时明显升高并与其心血管功能不全密切相关；推测：糖尿病时升高的内源性ADMA可能通过诱发心肌内质网应激反应促进糖尿病心肌病的形成。为了证实这一推测，本课题以链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠，揭示内源性ADMA升高与糖尿病心功能不全和心肌内质网应激的相关性；同时观察抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（N-Acetylcysteine,NAC）和内质网应激抑制剂4-苯基丁酸（4-phenylbutyric acid,4-PBA）对糖尿病心肌病的治疗效果以及对内源性ADMA蓄积和心肌内质网应激的影响，进一步探讨ADMA促糖尿病心肌病形成的可能机制；此外，在原代培养的新生大鼠心肌细胞，确定ADMA与糖尿病心肌内质网应激的因果关系。　　方法：本课题分为动物（体内）实验和细胞（体外）实验两部分。　　（1）动物实验：将SPF级8周龄雄性SD大鼠（体重180～200g）随机分成6组：①正常对照组（Control）：每天灌胃给予等体积生理盐水；②糖尿病组（DM）：一次性腹腔注射链脲佐菌素（STZ，50mg/kg溶于0.1mol/L pH4.5的柠檬酸缓冲液）诱导糖尿病，每天灌胃给予等体积生理盐水；③糖尿病+N-乙酰半胱氨酸组（DM+NAC）：DM大鼠每天灌胃给予抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（NAC,250mg/kg）治疗；④N-乙酰半胱氨酸对照组（NAC）：正常大鼠每天灌胃给予250mg/kg NAC；⑤糖尿病+4-苯基丁酸组（DM+4-PBA）：DM大鼠每天灌胃给予4-苯基丁酸（4-PBA,500mg/kg）治疗。　　（2）细胞实验：在原代培养的新生大鼠心肌细胞，分别用10~30μmol/L的ADMA孵育细胞24~96h，用Western blotting检测GRP78、p-eIF2α/T-eIF2α和CHOP的蛋白表达，观测ADMA对心肌细胞内质网应激的直接影响及其时效和量效关系，以明确糖尿病时内源性ADMA升高与心肌内质网应激的因果关系；再分别用10μmol/L NAC和3mmol/L4-PBA预孵育心肌细胞2h，然后与30μmol/L ADMA和30mmol/L葡萄糖共同孵育心肌细胞48h，观测上述药物对ADMA诱导心肌细胞内质网应激的治疗效果，以阐明ADMA诱导心肌细胞内质网应激的可能机制。　　结果：（1）动物实验：①与正常对照组大鼠比较，虽然糖尿病组大鼠的血脂未出现明显的改变，但血糖水平明显升高（P＜0.01），糖化血红蛋白含量也显著增加（P＜0.01），口服糖耐量试验（OGTT）时的血糖浓度-时间曲线下面积（AUC）增加（P＜0.01）；心肌组织p-Akt/T-Akt蛋白表达降低（P＜0.01），表明糖尿病组大鼠胰岛素敏感性降低，血糖升高，胰岛素信号通路受损，糖尿病大鼠模型制备成功；给予N-乙酰半胱氨酸和4-苯基丁酸治疗后可使糖尿病大鼠血糖浓度降低（P＜0.05）OGTT时的AUC减小（P＜0.05），糖化血红蛋白含量也明显降低（P＜0.01），但对心肌p-Akt/T-Akt蛋白表达无明显影响，提示N-乙酰半胱氨酸和4-苯基丁酸治疗后可改善糖尿病大鼠胰岛素靶组织对胰岛素的敏感性，但不改善心肌胰岛素抵抗。②糖尿病大鼠心脏体积增大，给予N-乙酰半胱氨酸和4-苯基丁酸治疗后都可使心脏体积缩小；心肌组织切片HE染色显示，糖尿病大鼠心肌细胞肥大，细胞核增大，细胞间隙增宽，N-乙酰半胱氨酸和4-苯基丁酸治疗后可改善心肌细胞的形态变化。　　（2）细胞实验：为了进一步探讨糖尿病大鼠内源性ADMA升高与心肌内质网应激的因果关系，本课题在培养的原代新生大鼠心肌细胞，观测ADMA对心肌细胞内质网应激的直接作用；结果发现，用30μmol/L ADMA孵育大鼠心肌细胞48h，可诱导p-eIF2α/T-eIF2α和CHOP等蛋白表达增加，用30mmol/L葡萄糖孵育原代心肌细胞48h也具有与ADMA相似的作用。　　结论：依据以上实验结果，可得出以下实验结论：　　1.给雄性SD大鼠一次性腹腔注射链脲佐菌素（50mg/kg）诱导糖尿病12周可促糖尿病心肌病形成；　　2.糖尿病心肌病大鼠伴有明显的心脏舒张功能和收缩功能障碍、心脏重构以及心肌内质网应激；　　3.糖尿病心肌病大鼠内源性NOS抑制物ADMA升高，可能是由于心肌PRMT1表达增加所致；　　4.相关分析提示，内源性ADMA升高是引起糖尿病心肌病大鼠心肌内质网应激的重要原因，并与糖尿病大鼠心脏舒张和收缩功能障碍密切相关；　　5.N-乙酰半胱氨酸和4-苯基丁酸治疗可改善糖尿病大鼠的胰岛素敏抵抗、降低血糖；抑制糖尿病大鼠心肌内质网应激，改善心脏舒张和收缩功能障碍；　　6.糖尿病时内源性ADMA升高可能通过诱导心肌内质网应激促糖尿病心肌病形成。