论文部分内容阅读
目 的子宫腺肌病的主要特征是子宫内膜过度生长,过度增生的内膜组织具有新生血管形成增加,细胞增殖能力提高、凋亡减少以及细胞粘附和侵袭能力增强等一系列肿瘤化特征。关于肿瘤的研究发现,干扰素/维甲酸联合应用诱导细胞凋亡相关基因(gene associated with retinoid-interferon-induced mortality-19,GRIM-19)参与调控细胞凋亡、增殖等生物学行为。本研究的目的是探讨子宫腺肌病中GRIM-19表达降低的原因以及M2巨噬细胞在子宫腺肌病发病中的作用。方 法体内实验:收集正常子宫内膜组织作为对照组(分泌期15例)、子宫腺肌病异位子宫内膜作为实验组(分泌期15例)。采用免疫组化法检测实验组和对照组中GRIM-19、Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)的定位和表达情况;采用原位末端转移酶标记技术(TUNEL)分析细胞凋亡情况;Western blot技术分析对照组与实验组GRIM-19、TLR4和caspase-3的蛋白表达水平。体外实验:(1)通过转染GRIM-1 9-siRNA下调hESC细胞中GRIM-19的表达,采用AnnexinV/PI染色和TUNEL荧光染色检测细胞凋亡水平的变化;采用Cell Counting Kit-8(CCK8)检测细胞增殖水平的变化;采用TRANSWELL细胞侵袭实验检测细胞迁移能力的变化;采用Western blot技术检测TLR4和caspase-3蛋白变化水平。(2)将THP-1来源的M2巨噬细胞与hESC细胞共培养,采用AnnexinV/PI染色和TUNEL荧光染色检测hESC细胞凋亡水平的变化;采用CCK-8检测hESC细胞增殖水平的变化;采用TRANSWELL细胞侵袭实验检测hESC细胞迁移能力的变化;采用Western blot技术检测hESC 细胞 GRIM-19、TLR4 和 caspase-3 蛋白变化水平;采用 Real-time RCR技术检测GRIM-19 mRNA的表达变化。(3)采用TLR4激活剂和抑制剂刺激hESC细胞,Western blot技术检测GRIM-19的蛋白水平的表达。结 果(1)GRIM-19主要在正常子宫内膜与异位内膜的腺体胞质中表达,且子宫腺肌病异位组织中GRIM-19蛋白水平较对照组显著下降(P<0.001)。(2)TUNEL染色显示子宫腺肌病异位子宫内膜凋亡水平较对照组降低(P<0.01)。(3)hESC细胞系中GRIM-19表达下调后,流式细胞技术检测结果显示凋亡细胞(右下象限)所占比例降低(P<0.01),TUNEL染色结果显示凋亡细胞数目减少(P<0.01),CCK-8结果显示细胞增殖能力增强(P<0.001),TRANSWELL实验表明细胞迁移能力提高(P<0.01),Western blot结果显示实验组细胞caspase-3蛋白水平降低(P<0.05)。(4)hESC细胞与THP-1来源的M2巨噬细胞共培养后,Western blot结果显示hESC细胞GRIM-19蛋白表达水平降低(P<0.05),Real-time PCR结果显示hESC细胞GRIM-19 mRNA表达水平降低(P<0.001)。(5)将hESC细胞与M2巨噬细胞共培养后,流式细胞术检测结果显示hESC细胞中凋亡细胞所占比例降低(P<0.001),TUNEL染色显示凋亡细胞数目减少(P<0.01),CCK-8结果显示共培养后hESC细胞增殖能力增强(P<0.001),TRANSWELL实验表明共培养后hESC细胞迁移能力提高(P<0.01),Western blot结果显示共培养后hESC细胞caspase-3蛋白水平降低(P<0.01),(6)hESC细胞与M2巨噬细胞共培养后,Western blot结果显示hESC细胞TLR4蛋白水平降低(P<0.01),Real-time PCR结果显示hESC细胞TLR4 mRNA 水平降低(P<0.05)。(7)hESC细胞中加入TLR4激活剂LPS处理后,Western blot结果显示GRIM-19蛋白表达水平提高(P<0.05),当加入抑制剂TAK-242后,Western blot结果显示GRIM-19蛋白表达水平降低(P<0.05)。(8)免疫组化结果显示子宫腺肌病异位组织TLR4蛋白水平较对照组显著下降(P<0.001),Western blot结果显示TLR4蛋白下降(P<0.05)。结 论M2巨噬细胞可能通过TLR4调控GRIM-19的表达,进而改变内膜细胞凋亡、增殖及迁移能力,参与子宫腺肌病的发生。