蛋白质组学、蛋白药物和来自动植物等天然产物中的蛋白的分离和纯化的研究都需要液相色谱法快速分离技术。Peter Carr小组最近提出快速分离的目标：一维液相色谱分离要在1～10 min内完成,二维液相色谱分离要在10～100 min内完成。尽管这个建议是针对多肽提出的,但是也可以作为整体蛋白快速分离的目标。在本文中,利用蛋白质在液-固界面的不连续迁移和色谱饼这种柱技术,首次建立了一分钟整体蛋白液相色谱法。一般的快速分离仅仅包含了蛋白分离过程,而一分钟整体蛋白液相色谱在1 min内完成分离过程和色谱饼再生过程。分别用标准蛋白检测了反相色谱法、离子交换色谱法和疏水相互作用色谱法三种模式的一分钟整体蛋白液相色谱法,蛋白质分离度没有明显地损失。除了分离速度快分离能力强,该技术还有负载量高的优点。论文包括了以下6个部分：1.绪论说明了色谱法快速分离的意义。介绍了一维快速分离蛋白质的方法,包括非多孔固定相、整体固定相、灌注色谱法、高温快速液相色谱法和色谱饼法；还介绍了二维色谱快速分离蛋白质的方法,包括了常规的使用多根不同机理色谱柱的二维液相色谱法(2D-LC)和使用一根有两种正交分离能力色谱柱的单柱二维液相色谱法(2D-LC-1C)。2.多孔反相填料对整体蛋白的高速、高分离度和高负载量分离使用侧孔装填技术把3μm的C18反相多孔填料装填在超薄色谱饼(1 mm×10 mmI.D.,78μL)中,用于7种标准蛋白混合物的分离。首次比较了小柱床体积的色谱饼和大柱床体积的色谱柱(50mm×4.6mm I.D.,830μL)分离小分子和整体蛋白的效果。由于小分子在色谱柱(饼)床上的迁移是连续的,导致色谱饼分离小分子的效果远远差于色谱柱。而蛋白质在液-固界面存在“粘附能”,使得蛋白质在色谱柱(饼)床上的迁移是不连续,造成色谱饼分离蛋白质的效果与色谱柱相当。由于色谱饼内径大柱长短的特殊结构,其动力学性质远好于色谱柱,可以在高达10 mL／min的流速下使用。在优化条件下用色谱饼在30 s内分离了7种蛋白。在5 min内连续5次快速分离蛋白质。表明当固定相和蛋白质之间的作用力是非选择性作用力时,一分钟整体蛋白液相色谱法是可以实现的。在1 min内还基线分离了总量是1 mg的7种蛋白的混合物,实现了高速、高分离度和高负载量的“三高”效果。该方法有希望用于临床例行分析。3.多孔弱阳离子交换填料对整体蛋白的“三高”分离比较了两种弱阳离子交换商品填料TSKgel CM-5PW和PolyCAT A分离蛋白的效果,填料PolyCAT A(粒径,3μm；孔径,150 nm)更适合实现一分钟整体蛋白液相色谱法。PolyCAT A色谱饼(1 mm×10 mm I.D.)和色谱柱(50 mm×4.6 mm I.D.)的分离能力相当。然而,色谱饼的动力学性质更好。在优化的条件下,在18 s内分离了4种标准蛋白。分离速度比整体固定相和无孔填料都要快,分离效果也更好。在10 min内连续进行了10次的蛋白分离,证明了当固定相和蛋白质之间的作用力是静电相互作用力时,也可以实现一分钟整体蛋白液相色谱法。另外用PolyCAT A色谱饼在1 min内快速分离了总量1 mg的4种蛋白混合物。4.无孔疏水填料快速分离整体蛋白用装填2.5 gm的无孔疏水填料的色谱饼(10 mm×10 mm I.D.)和色谱柱(35 mm×4.6 mm I.D.)来分离蛋白质。在优化的条件下,用色谱柱在3.5 min内可以分离7种蛋白的混合物,而使用色谱饼仅仅需要2.1 min就可以完成类似的分离。色谱饼的动力学性质更好,可以在更大的流速下分离蛋白质,更适合快速分离。尽管得到的结果大于1min,但是比较接近一分钟整体蛋白液相色谱法的目标。5.无孔反相色谱填料对整体蛋白的“三高”分离用装有1.0μm无孔反相填料色谱饼(7.5 mm×10 mm I.D.)首次在常规色谱条件下1min分离1μg和40μg的7种标准蛋白,并且在1 min内几乎完全分离0.5 mg该7种蛋白的混合物,达到高速、高分离度和高负载的“三高”效果。开辟了用常规液相色谱仪快速分离高负载蛋白的新途径。6.多孔二维色谱(SAX-HIC)填料及其在疏水模式下的一分钟整体蛋白色谱法与相应模式的一维色谱填料相比,二维色谱填料有改善分离选择性的优点,因此合成了一种多孔强阴离子交换-疏水相互作用二维色谱(SAX-HIC)填料来改善填料在HIC模式下的分离能力。用该填料装填的二维色谱饼(1 mm×10 mm I.D.)在HIC模式下分离蛋白。在5 mL／min流速下1 min内不仅快速分离了6种蛋白质,还平衡了色谱柱。其分离速度和效果是一般的疏水填料难以达到的。该结果证明了由疏水相互作用力控制的疏水色谱完全可能实现一分钟整体蛋白色谱法。