可注射型去端肽胶原包埋MSCs对兔椎间盘退变的早期修复作用

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第一部分:可注射型去端肽胶原包埋兔骨髓基质干细胞的体外培养目的:对兔骨髓基质干细胞(MSCs)进行体外培养、扩增及鉴别,并探讨MSCs与去端肽胶原共同培养后MSCs的生长、存活情况,为进一步研究提供实验基础。方法:行胫骨穿刺抽取骨髓2mL,倒置显微镜下观察其原代及传代后细胞形态,使用流式细胞仪分析细胞表面标记物CD34、CD44、CD90。证明是骨髓基质干细胞后将其与可注射型去端肽胶原复合培养,使用倒置显微镜、双醋酸-碘化丙啶(FDA-PI)双荧光染色观察MSCs在凝胶内的存活生长情况。结果:体外成功培养并扩增兔MSCs细胞,细胞高表达CD44、CD90、不表达CD34。倒置显微镜观察见MSCs在凝胶内生长良好,培养7天即出现少量典型长梭形形态;FDA-PI双染色示MSCs在凝胶内存活良好,培养14天存活率>99%,未见明显死亡细胞。结论:经密度梯度法分离培养的细胞是MSCs,同时MSCs在去端肽胶原凝胶内生长、存活良好,不影响其生物活性;去端肽胶原与MSCs具有良好的生物相容性。第二部分:可注射型去端肽胶原包埋骨髓基质干细胞对兔椎间盘退变的早期修复作用目的:探讨兔骨髓基质干细胞(MSCs)复合可注射型去端肽胶原移植治疗兔椎间盘退变的可行性,为后续的临床研究提供实验基础。方法:新西兰白兔20只,随机分为3组:1)正常组(n=4),不做任何处理;2)假手术组(n=8),只针刺抽吸髓核法诱导椎间盘退变模型;3)移植组(n=8),进行退变模型建立并行MSCs-去端肽胶原复合物移植治疗。将MSCs-去端肽胶原复合物注射移植入退变椎间盘后4周、6周,每个时间点正常组2只,假手术组4只,移植组4只,行腰椎侧位X光片检测椎间盘高度,并计算椎间盘高度指数(DHI);腰椎MRI测量椎间盘T2加权像信号强度变化;大体观察、HE染色观察椎间盘退变程度并分级;RT-PCR检测椎间盘II型胶原及聚集蛋白聚糖的基因表达。结果:DHI在正常组未见明显下降,移植组可见轻度狭窄,而假手术组明显狭窄,移植组DHI%与其余各组间相比具有明显差异(P<0.05)。MRI结果显示移植组与假手术组椎间盘信号强度均有不同程度的下降,但移植组信号强度明显强于假手术组,且具有统计学意义(P<0.05)。大体观察及组织学检查结果显示,假手术组椎间盘结构明显退变,纤维环疤痕增生严重,髓核组织缺失。移植组纤维环结构稍紊乱,可见再生髓核组织。组织学评分提示移植组评分明显优于假手术组(P<0.05)。RT-PCR结果显示移植组椎间盘组织II型胶原及聚集蛋白聚糖mRNA表达水平强于假手术组,具有显著差异(P<0.05)。结论:MSCs细胞复合可注射型去端肽胶原移植入退变椎间盘中,经X线,MRI,病理学检测及RT-PCR检查证实可以延缓椎间盘的进一步退变,可增加椎间盘II型胶原及聚集蛋白聚糖的含量,对恢复椎间盘退变具有良好的治疗效果,具有广阔的应用前景。
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