青光眼是一类以眼压病理性升高为主要特征的致盲性眼病，原发性开角型青光眼(primary open angle glaucoma，POAG)是其中最常见的类型之一，发病机制至今尚未明了。异常升高的眼内压是POAG发生和进展的最主要的危险因素。作为房水外流通路的主要部位，小梁网在眼内压的调控过程中起着重要作用。该流出通道不畅将直接引起眼压升高。然而，房水流出阻力产生的原因，至今尚未完全清楚。 嘌呤信号转导在小梁网房水流出的调控方面有一定的作用。已经证明，小梁网细胞上有嘌呤家族的腺苷受体A1、A2、A3和三磷酸腺苷(ATP)受体P2Y1、P2Y2、P2Y4和P2Y11表达，不同的受体介导不同的功能：如A3受体的激活可以开放眼房水中的非色素睫状体上皮细胞的c1-通道，促进房水分泌，而A3受体拮抗剂可以增加房水排出，降低眼内压；腺苷受体A1被ATP激活后可增加小梁网细胞分泌基质基金蛋白酶—2(MMP—2)；而P2Y2受体则与小梁网细胞容量变化有关等。 P2X7受体属嘌呤家族的P2X亚家族成员，是近年来发现的、一种有其独特特点的ATP门控离子通道，ATP是其天然的激动剂。ATP激活P2X7受体离子通道，可引起一系列相应的生物学效应，如Ca2+内流、细胞凋亡及细胞容量改变等。另外，它还与多种细胞因子联系紧密。 在本研究中，我们分别培养了正常人眼和POAG病人小梁网细胞，并发现两者均有P2X7受体的表达，且POAG病人组小梁网细胞P2X7受体的表达水平高于正常人组。P2X7受体激动剂ATP可引起体外培养的两种细胞死亡和细胞容量改变，随着ATP浓度增加，死亡细胞数目增加，平均细胞容量增大；且POAG病人组比正常人眼组小梁网细胞更早发生凋亡高峰。在此基础上，我们推测P2X7受体可能对房水流出调节机制有一定影响。本课题立题旨在探讨嘌呤信号转导在青光眼发病机制中的作用，为青光眼发病机制及防治提供新的思路。 本课题的研究主要分为以下两个部分： 第一部分 正常人和青光眼病人小梁网细胞上P2X7受体的表达 一．研究目的 纯化培养鉴定正常人(NTMC)和POAG病人小梁网细胞(GTMC)，研究P2X7受体的表达及其表达差异。 二．研究方法 1.材料来源：正常人眼小梁网组织来源于角膜移植后剩余的正常人新鲜眼球，高眼压青光眼小梁组织来源于本中心青光眼病区POAG患者术中收集； 2.方法：将角膜移植后及青光眼手术后收集的小梁组织按组织块培养法进行体外细胞培养，其中有细胞生长的统一传至第3代进行鉴定。成功培养的小梁网细胞取第4、5、6代进行试验。利用Real—time PCR检测两种小梁网细胞上P2X7受体的mRNA表达差异，利用免疫荧光和Western—Blotting法检测两种小梁网细胞上P2X7受体蛋白的表达差异。 三．结果 体外培养两种小梁网细胞均成功，表现为第3代细胞进行形态学、免疫学鉴定均满足小梁网细胞的特征。分别取第4、5、6代的细胞进行Real—time PCR、免疫荧光和Western—Blotting法后证实两种小梁网细胞均有P2X7受体的mRNA和蛋白表达，且表达有差异：GTMC上P2X7受体的表达水平高于NTMC。统计学结果显示此差异有统计学意义。 第二部分 ATP受体P2X7激活引起人眼小梁网细胞死亡和容量改变 一．研究目的 检测ATP受体P2X7对小梁网细胞死亡和细胞容量变化的影响，初步探讨P2X7受体在青光眼发病机制中的作用，为青光眼发病机制及防治提供新的思路。 二．方法与材料 1.用TUNEL(terminal deoxynucleotidyl transferase—mediated dUTP nick end labeling，末端脱氧核苷酰基转移酶介导性dUTP切口末端标记法)、hoechst33258染色法检测死亡细胞形态变化； 2.用AnneviX V/PI双染法结合流式细胞仪检测P2X7受体激动剂ATP对小梁网细胞死亡及细胞容量的影响； 三．结果 TUNEL检测法和hoechst33258染色显示经ATP作用后两种细胞均发生了明显的凋亡形态学改变；在ATP浓度分别为0、1、5、10 mmol/L，作用时间为2小时，NTMC和GTMC坏死细胞数分别为1.7％、3.1％、27.2％，50.2％和0.8％、2.2％、11.2％、48.1％，凋亡细胞数分别为0.2％、2.4％、9.9％、15.4％和0.5％、4.2％、11.6％、4.2％，平均体积变化分别为554.68、683.69、709.01、884.77和330.12、401.02、514.42、594.02 um，均呈递增趋势；在ATP浓度为5mmol/L时，GTMC比NTMC更早出现了凋亡高峰。 结论： NTMC和GTMC上均存在P2X7受体的表达，且GTMC组P2X7受体的表达水平高于NTMC组，这是首次在人眼小梁细胞上证实有ATP受体P2X7的表达；P2X7受体激动剂ATP可引起体外培养的NTMC和GTMC死亡和细胞容量改变，随ATP浓度增加，死亡细胞数目增加，平均细胞容量增大；且GTMC比NTMC更早发生凋亡高峰。推测P2X7受体可能对房水流出调节机制有一定影响。