论文部分内容阅读
活性氧自由基（reactive oxygen species,ROS）是指活泼的氧自由基与具有氧自由基反应特性的其它含氧物质的总称,主要包括超氧阴离子(O2—)、羟自由基（OH-）、过氧化氢（H2O2）及单线态氧等。在正常情况下,低水平的ROS是细胞行使生物学功能所必需的,因为ROS可参与细胞内许多重要途径的信号转导调控。但在某些特殊的情况下,比如细胞自身氧化还原代谢紊乱或外界离子辐射等原因就会造成细胞内ROS的大量积聚,这种过量的ROS可以攻击蛋白质、脂质及DNA而造成生物大分子的损伤。虽然ROS对蛋白质、脂质、糖类等均可引起不同程度的损伤,但其对DNA的氧化损伤及其与疾病、肿瘤、细胞衰老的关系越来越受到科学界更为广泛的关注。作为单细胞真核生物的酿酒酵母,本身不仅具有高度的遗传可操作性,而且过去几十年以其作为模式生物的研究已经使人们对一些基础的细胞生物学过程及人类一些复杂疾病,如Creutzfel-Jacob病、Parkinson’s病及癌症等发生机制的认识上取得了许多关键性的进展。与此同时,酿酒酵母作为衰老分子生物学研究的三大模式生物之一,对许多与衰老过程相关问题的研究具有其它生物无可比拟的独特优势。本论文工作在对细胞不同反应修复体系应对氧化应力造成的DNA损伤进行较为系统研究的基础上,就基因组DNA氧化损伤及其结构稳定性与细胞衰老过程间的关系进行了系统研究,对可能的作用机制进行了初步探讨。本文主要的工作内容及结果如下:1.利用不同DNA损伤修复反应途径的基因缺失菌株,从遗传学角度分析并初步建立了针对基因组DNA氧化损伤的细胞反应修复网络体系。通过分析比较选择获取了抗氧化途径、DNA损伤修复途径以及DNA损伤检验点途径的一些关键基因敲除菌株。对得到的基因敲除菌株通过测定CAN1基因座位的突变频率,检测了相关基因功能缺陷对菌株基因组稳定性的影响,结果显示所有突变体的CAN1基因座位突变频率都高于野生型菌株,说明这些基因即使在正常生理条件下在维持基因组稳定性方面也发挥着重要的作用。进一步对所有突变体对不同浓度双氧水的敏感性测定结果显示,几乎所有突变体都比野生型菌株对双氧水更为敏感,其中活性氧清除体系中的CTT1,SRX11,TSA1,DNA损伤修复途径的APN1APN2,DNA复制检验点途径的SGS1以及DNA损伤检验点途径的MEC1,TEL1,RAD53,DUN1基因缺失后,细胞对H2O2更为敏感,说明这些基因在细胞的抗氧化胁迫中发挥着重要的作用,从而初步建立了DNA氧化损伤反应修复网络体系。2.通过分析测定DNA氧化损伤反应修复体系基因缺失菌株的实足寿命,系统研究了DNA氧化损伤反应修复体系与细胞衰老过程的内在联系利用活菌计数结合总细胞数测定的方法系统地研究了DNA氧化损伤反应修复体系基因缺失菌株的实足寿命。结果表明,DNA氧化损伤反应修复体系的基因缺失后,导致细胞的实足寿命比野生型菌株有不同程度的缩短。其中DNA复制检验点途径的sgs1Δ的实足寿命缩短的最为明显;DNA损伤检验点途径的基因缺失菌株,如mec1Δ,chk1Δ,rad53Δ和te11Δ,寿命也明显短于野生型菌株,其中mec1Δ,chk1Δ,rad53Δ比te11Δ还要更短一些;虽然抗氧化途径的tsa1Δ突变体实足寿命也有一定程度的缩短,但效果不如DNA复制检验点和损伤检验点的基因缺失菌株明显;而DNA损伤修复途径的基因缺失菌株除了同源重组途径的rad51Δ外,其它缺失菌株的实足寿命比野生型菌株并没有特别明显的缩短。对DNA氧化损伤反应修复体系基因缺失菌株实足寿命缩短的现象也通过PI染色检测细胞膜完整性以及Fun1染色检测细胞代谢活性的方法进行了验证,实验结果与上述用涂布平板活菌计数方法得到的结果是一致的,且显微镜的观察结果也显示细胞在衰老过程中仍保持完整,且呈现出衰老的表型。综上结果,我们在研究酵母细胞实足寿命的过程中发现,通常所用的平板活菌计数方法所测定的细胞数量与培养液中保持形态完整的细胞数量存在很明显的差异,也就是说细胞进入静止期后,相当数量的细胞虽然仍在相当长的时间内保持细胞形态的完整,但丧失了在适宜条件下继续分裂繁殖的能力,而这种现象在DNA氧化损伤反应修复体系相关基因缺失菌中尤为明显。3.对DNA氧化损伤反应修复体系对实足寿命的影响机制进行了初步探讨。ROS的测定结果表明,培养过程中各种相关突变体内的ROS水平均高于野生型菌株,且所有突变体胞内的ROS随着细胞培养时间的延长而不断的积累,其水平的高低与实足寿命的长短基本一致,从而暗示胞内ROS水平的累积与细胞实足寿命间的某种内在联系;对细胞内DNA点突变积累的测定结果表明,DNA损伤修复途径的突变体虽然存在较高的点突变积累,但其实足寿命并没有表现出相应的缩短,而一些DNA损伤积累比较低的菌株如DNA损伤检验点以及DNA复制检验点途径的突变体,其实足寿命反而比较短。原因很可能是DNA损伤修复途径突变体胞内大量随机的点突变的累积并没有影响到染色体DNA的复制过程,而DNA损伤检验点途径和DNA复制检验点途径的基因缺失菌则可能因为整体协调机制的失效造成基因组大范围结构的改变或重排,并最终直接或间接地影响到染色体的复制,并由此引起其它检验点如细胞壁形态检验点的失调而影响到细胞进一步分裂繁殖的能力;对这些突变体的细胞壁对SDS和lysing enzyme敏感性的测定结果显示,突变体的细胞壁对SDS和lysing enzyme比野生型敏感,且其敏感程度与实足寿命的长短呈正相关,暗示着突变体实足寿命的降低很可能是因为DNA氧化损伤反应修复体系的基因缺失影响了细胞壁表型检验点,使其合成的细胞壁比较脆弱,所以最终导致了突变体实足寿命缩短。4.通过在酵母细胞中表达对氧化还原敏感的绿色荧光蛋白roGFP1-R12,建立了一种通过检测胞内氧化还原平衡状态改变以评价环境中重金属潜在遗传学毒性的灵敏方法。造成DNA氧化损伤的细胞内活性氧自由基（ROS）主要来源于两方面,一是细胞自身正常生理代谢,二是外源环境。本文将对氧化还原状态变化敏感的绿色荧光蛋白roGFP1-R12,在酵母细胞中实现了多拷贝强表达;荧光扫描经强氧化剂H2O2和还原剂DTT以及环境中重金属NaAsO2或Pb（NO3）2处理后的酵母细胞悬液,测定510 nm处的荧光发射强度结果显示,表达的绿色荧光蛋白对氧化还原水平敏感,且在510 nm处的荧光强度与一定的重金属浓度呈正相关,即roGFP1-R12在510nm处的荧光发射值随重金属浓度的增高而增强,从而说明重金属对细胞的毒性在一定程度上很可能是通过破坏细胞内的氧化还原平衡发生作用;同时通过该绿色荧光蛋白对胞内氧化还原状态变化的响应情况可以来实时检测环境中的重金属;遗传学的点突变频率及致死率实验数据表明,重金属能导致菌体的点突变频率和致死率升高,且活性氧的清除剂巯基脲能明显降低这种点突变和致死率,说明由重金属引发的这种点突变和致死效应在很大程度上是依赖于重金属对细胞诱导产生的氧化胁迫。