禽流感病毒宿主范围广泛,不仅可以感染各种禽类,对家禽养殖业造成重大的经济损失,偶尔也可感染人类,因其感染后引起的高死亡率而严重危害着人类的生命健康。流感病毒的生存严格依赖于宿主细胞,病毒的感染、复制、致病以及逃避宿主免疫离不开与宿主各种蛋白发生相互作用。非结构蛋白NS1是流感病毒的一个重要的毒力因子,它能够通过多种策略逃避宿主免疫反应而调节病毒的复制。NS1蛋白的81-113位氨基酸能够招募宿主蛋白真核翻译起始因子4GI(eIF4GI)到病毒m RNA 5’端未翻译区,优先翻译病毒m RNA,促进病毒复制。本实验室前期研究发现NS1片段缺失eIF4GI结合区的重组H5N1禽流感病毒(rNS1-SD30)相对于野生病毒(rNS1-wt),在体内和体外实验中其毒力和致病性都显著地降低,并且在MDCK细胞上抑制干扰素的能力也受到损伤。然而重组缺失毒rNS1-SD30感染引起的宿主蛋白变化,以及有那些宿主因子参与了毒力及其致病的降低的作用机制还不清楚。不均一核糖核蛋白(HNRNPs)家族蛋白的功能繁多,主要参与细胞中m RNA的剪接、转录、稳定、翻译和转运等的调节功能,一些蛋白还参与了宿主的免疫调节。近年来有关HNRNPs调控病毒复制的研究越来越多,通过调节病毒m RNA的剪接以及与病毒蛋白互作调节病毒复制,而HNRNPK参与了多个病毒的复制过程。HNRNPK直接与甲型流感病毒的M1 m RNA结合促进M1 m RNA剪接产生M2m RNA,导致编码产生的M2蛋白增多,进而促进流感病毒的复制。然而HN RNPK与流感病毒蛋白的相互作用以及是否参与了宿主的天然免疫调节还不清楚。本研究采用比较蛋白质组学的方法研究了rNS1-wt及rNS1-SD30病毒感染鸡胚成纤维(CEF)细胞后蛋白质的差异表达情况,研究了差异表达蛋白ANXA7对病毒增值以及禽天然免疫调节的作用,还研究了人源HNRNPK与流感病毒的相互作用以及调控IFN产生的作用机制。本研究主要研究内容和结果如下:1.rNS1-wt及rNS1-SD30病毒感染CEF的蛋白质组学研究rNS1-wt及rNS1-SD30病毒感染CEF 12h,24h和36h后运用蛋白质组学鉴定到81个差异表达宿主蛋白,对鉴定到的蛋白进行功能分类分析,发现这些差异蛋白主要参与了细胞骨架的形成、凋亡和应激反应、转录调节、m RNA加工剪切、运输和代谢以及信号转导等进程。进而克隆表达部分基因并研究其对病毒复制的影响,发现ANXA7抑制rNS1-SD30在DF1细胞的增殖,而对rNS1-wt并没有影响。2.ANXA7通过调节MDA5的表达正调控鸡RLR信号通路构建了鸡RLR信号通路研究平台,发现ANXA7、ALDH7A1及DCTN2等蛋白促进MDA5诱导的IFN-β产生。进一步研究发现ANXA7促进rNS1-SD30刺激的IFN-β产生,而并不影响rNS1-wt诱导的IFN-β产生。ANXA7促进poly I:C及MDA5介导的IFN-β产生通过靶向MDA5并调节其蛋白表达,同时ANXA7与MDA5存在相互作用,其C端钙离子磷脂结合区是促进IFN-β的关键区域。3.人源HNRNPK通过与NS1蛋白互作促进流感病毒增殖流感病毒感染A549细胞下调HNRNPK的表达,同时过表达HNRNPK显著促进多个亚型流感病毒的增殖,沉默HNRNPK抑制病毒的增殖。进一步发现HNRNPK与NS1存在RNA非依赖性的相互作用,NS1的N端RBD以及HNRNPK的RNA结合区KH2和蛋白-蛋白互作区KI是NS1与HNRNPK发生相互作用的关键区域。HNRNPK的RNA结合区KH2和核穿梭区KNS是促进流感病毒增殖的关键区域。4.HNRNPK抑制IFN-β产生并参与到NS1逃避的天然免疫研究发现HNRNPK抑制流感病毒和仙台病毒(Sev)介导的IFN-β产生以及IRF3的磷酸化。进一步研究发现HNRNPK与RIG-I信号通路的TRAF3发生相互作用,HNRNPK的两个RNA结合区KH1和KH2以及蛋白互作区KI和TRAF3的RIN G finger在TRAF3与HN RNPK的相互作用中起着关键作用。此外,研究发现HNRNPK能够增强NS1蛋白抑制的流感病毒介导的IRF3磷酸化,并且HNRNPK的存在有利于NS1-TRAF3复合物的形成。