论文部分内容阅读
棉花不仅作为纺织行业最普遍的天然原料在全球经济中发挥着重要的作用,而且由于其棉纤维拥有单细胞以及次生壁加厚的特性,一直以来被视为研究植物细胞壁形成以及纤维素生物合成的理想模型。随着全球环境的持续恶化,高温、干旱以及土地盐碱化等胁迫环境严重阻碍了棉花产业发展。因此,开展棉花的适应非生物胁迫的机制研究,利用分子生物学手段提高棉花的胁迫耐受能力显得尤为重要。目前,关于棉花的抗逆研究主要集中于重要抗逆基因的挖掘上,但是基因表达是一个错综复杂的网络,受microRNA等其他因子的调控。已有报道发现环状RNA（circular RNA,circRNA）可以竞争性地结合miRNA,从而调控mRNA的表达。circRNA是一类不存在游离末端的稳定的RNA,是由反向剪接形成,不含5’帽子结构和3’polyA尾的内源非编码RNA。但是目前针对棉花在非生物胁迫下的circRNA的研究鲜见报道。本研究以亚洲棉（Gossypium arboreum）石系亚1号为研究对象,首先对其幼苗进行了冷、热、盐和UV-B辐射等四种非生物胁迫处理,对胁迫处理后的幼苗进行转录组测序。随后利用生物信息学手段分析了 circRNA的特征及不同胁迫条件下circRNA及mRNA的表达情况,同时分别分析了 circRNA与miRNA的相互作用及miRNA与mRNA的相互作用,最后构建了一个circRNA-miRNA-mRNA的共表达互作网络,预测了三者之间可能的调控作用。探讨了 circRNA在棉花非生物胁迫响应中的潜在作用,试图挖掘与非生物胁迫相关的circRNA标记物,为将来植物抗逆机制的深入研究提供信息参考。本研究的主要结果如下:（1）本研究共构建了 10个circRNA测序文库,测序后共获得209.6 G原始数据,约98%的reads可以比对到参考基因组上,样本间重复性较好,皮尔森系数r>0.8,P value<0.001。（2）利用KNIFE和CIRCexplorer2软件对circRNA进行预测鉴定,分别在冷胁迫,热胁迫,盐胁迫,UV辐射中鉴定到了 circRNA。通过比较总RNA建库测序与circRNA建库测序的鉴定效果,发现使用circRNA建库测序对circRNA的检出率提高显著。随机选取100个不同表达量的circRNA进行RT-PCR及测序验证,33个circRNA的真实性得到验证。（3）对高可信度的circRNA进行了特征分析,发现多外显子基因更易产生circRNA,circRNA倾向于在可变剪切更多的基因中产生,较长的内含子可能对于形成circRNA有一定促进作用,叶绿体基因组是circRNA形成的热点区域,且其产生circRNA的基因类型相对保守,但是环化产生circRNA的位点不保守。（4）circRNA的差异表达情况表明非生物胁迫会影响circRNA的表达:冷胁迫导致306个circRNA表达上调,15个表达下调;热胁迫导致44个circRNA表达上调,14个表达下调;盐胁迫导致33个circRNA表达上调,141个表达下调;UV辐射导致290个circRNA表达上调,34个表达下调。然而值得注意的是其亲本基因对相应的非生物胁迫的响应与circRNA的响应相关性较低。（5）通过构建circRNA、miRNA及mRNA的相互作用网络,分析发现circRNA与miRNA或mRNA可以形成多对一或一对多的互作模式。miR8633靶向多个mRNA,我们推测Circ-Ga01g060和Circ-Ga11g239通过抑制miR8633与mRNA的结合,导致热胁迫响应基因表达上调。