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背景和目的:青光眼不可逆的视神经损害对人类视觉质量构成极大的威胁,深入了解青光眼视神经损害发生发展机制及开发视神经保护药物的形式刻不容缓。研究发现由高眼压(high intraocular pressure,HIOP)导致的视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)进行性凋亡是青光眼视神经损害的根本原因。另外,抑凋亡和促凋亡信号因子的相对表达对RGCs凋亡具有重要调控作用,而NGF/ASK1/FoxO1通路与NGF/AKT/CREB通路与细胞凋亡密切相关,因此NGF/ASK1/FoxO1通路与NGF/AKT/CREB通路可能参与RGCs凋亡相关机制。既往青光眼视神经保护以活血通络为主,滋养肝肾较少,滋养肝肾、活血通络同用者罕见,系统研究更少。补精益视片为中医眼科名家陈达夫教授经验方,具有滋养肝肾、活血通络的作用,作为补肾活血法代表方,我们前期临床及动物实验均已明确其对青光眼具有较好的视神经保护作用,其具体作用机制尚需进一步探索。本研究首先通过体外高压诱导、成功构建RGCs凋亡模型,观察不同压力梯度对RGCs凋亡的影响,从NGF/ASK1/FoxO1与NGF/AKT/CREB通路的角度研究其机制,然后建立Shareef-Sharma大鼠慢性HIOP模型,探讨补肾活血法(补精益视片)对以上通路的干预效应和机制。旨在传承并发掘名老中医经验,从而为青光眼视神经保护创新新思路、提供新方法。实验一:基于NGF/ASK1/FoxO1、NGF/AKT/CREB通路研究不同压力梯度对体外RGCs凋亡模型的影响及机制目的:HIOP是诱导RGCs凋亡的重要因素,然而,其潜在的机制尚未清楚。对离体状态下RGCs的病理学特征进行研究,可以避免细胞与细胞之间以及细胞与细胞外基质之间的相互作用和机体内环境的复杂性而导致的体内研究局限性,离体状态下RGCs凋亡模型(体外加压培养RGCs)是研究青光眼RGCs凋亡发生机制的理想模型。本部分实验基于NGF/ASK1/FoxO1、NGF/AKT/CREB通路研究不同压力梯度对体外RGCs凋亡模型的影响及机制。方法:采取开放式压力控制培养系统建立体外加压RGCs凋亡模型。将原代培养的SD大鼠RGCs分别暴露于0 mmHg、20 mmHg、40 mmHg、60 mmHg、80 mmHg5个压力梯度24 h,采用倒置显微镜观察RGCs的形态学变化、CCK-8和Annexin V-FITC/PI流式细胞术分别检测RGCs的活性和凋亡率、Western blot及qRT-PCR分别检测NGF、AKT、ASK1、FoxO1和CREB的蛋白表达和mRNA水平。结果:(1)成功建立体外加压培养RGCs的凋亡模型:40 mmHg组、60 mmHg组、80 mmHg组RGCs的活性明显低于0 mmHg组与20 mmHg组(均P<0.01),其凋亡率明显高于0 mmHg与20 mmHg(均P<0.01),20 mmHg组与0 mmHg组RGCs活性及凋亡率均无明显差异(P>0.05);另外,在40 mmHg、60 mmHg、80 mmHg中,RGCs细胞活性随压力的增高而逐渐下降(P<0.05),凋亡率则随着压力的增高而逐渐升高(P<0.05)。(2)不同压力梯度对RGCs的形态学变化的影响:0 mmHg组和20 mmHg组有极少量细胞出现细胞萎缩改变;40 mmHg组较多细胞萎缩或破坏;60 mmHg组大部分细胞神经突缩短,部分细胞解体或死亡;80 mmHg组细胞均出现严重的结构损害,已不可分辨其基本形态结构。(3)不同压力梯度对NGF通路相关蛋白NGF、AKT、ASK1、FoxO1和CREB表达的影响:与0 mmHg组相比,20 mmHg组NGF、AKT、ASK1、FoxO1和CREB蛋白表达水平无明显变化(P>0.05),而40 mmHg组、60 mmHg组和80 mmHg组的NGF、AKT、ASK1、FoxO1和CREB蛋白表达水平与0 mmHg组、20 mmHg组相比,则有明显差异(P<0.01),且NGF、AKT和CREB的蛋白表达水平随着压力的升高而逐渐下降(P<0.05),而ASK1、FoxO1蛋白表达水平则随压力的升高而逐渐增加(P<0.05)。(4)不同压力梯度对NGF通路相关蛋白NGF、AKT、ASK1、FoxO1和CREB mRNA表达的影响:与0 mmHg组相比,20 mmHg组NGF、AKT、ASK1、FoxO1和CREB mRNA表达水平均无明显变化(P>0.05);而40 mmHg组、60 mmHg组和80 mmHg组的NGF、AKT、ASK1、FoxO1、CREB mRNA与0 mmHg组、20 mmHg组相比,则有明显差异(P<0.01),且NGF、AKT和CREB的mRNA表达水平随着压力的升高而逐渐下降(P<0.01),而ASK1及FoxO1 mRNA表达水平则随着压力的升高而逐渐增加(P<0.05)。(5)NGF/ASK1/FoxO1通路和NGF/AKT/CREB通路的比较:20mmHg组NGF/ASK1/FoxO1通路ASK1、FoxO1蛋白及mRNA表达与NGF/AKT/CREB通路CREB蛋白及mRNA表达比较无明显差别(P>0.05)。而40mHg组、60mmHg组、80 mmHg组NGF/AKT/CREB通路CREB蛋白及mRNA表达变化量明显高于NGF/ASK1/FoxO1ASK1与FoxO1蛋白及mRNA表达变化量(均P<0.01)。表明在NGF相关通路中,NGF/AKT/CREB可能在压力引起RGCs凋亡中作用可能更重要。结论:(1)采取开放式压力控制系统可成功制作体外加压培养RGCs凋亡模型。(2)40 mmHg、60 mmHg、80 mmHg的压力均可诱导体外培养RGCs发生凋亡形态学改变,降低RGCs细胞活性,增加RGCs的凋亡率,20 mmHg却与0mmHg类似,未能引起相应改变。(3)调控NGF/ASK1/FoxO1和NGF/AKT/CREB通路可能均是压力导致RGCs凋亡的分子生物学机制。(4)NGF/AKT/CREB通路在RGCs凋亡中的作用可能更为明显。实验二:基于NGF/AKT/CREB通路研究补肾活血法(补精益视片)对大鼠慢性HIOP模型视网膜损伤及RGCs凋亡的影响及机制目的:我们前期临床及动物实验均已发现补肾活血法(补精益视片)对青光眼具有较好的视神经保护作用,且实验一“基于NGF/ASK1/FoxO1、NGF/AKT/CREB通路研究不同压力梯度对体外RGCs凋亡模型的影响及机制”研究中发现NGF/AKT/CREB通路在RGCs凋亡中可能发挥着更为重要的作用。为进一步探索补肾活血法(补精益视片)保护视神经机制是否有NGF/AKT/CREB信号转导通路参与,故建立Shareef-Sharma大鼠慢性HIOP模型,研究补肾活血法(补精益视片)对大鼠慢性HIOP模型视网膜损伤及RGCs凋亡的影响及机制。方法:采用烙闭上巩膜静脉法建立Shareef-Sharma大鼠慢性HIOP模型,60只大鼠随机分为正常组20只,给药组20只,模型组20只。监测大鼠眼压,分别于造模后3天及造模后2月行相关检测:高倍显微镜下观察视网膜形态结构,测量视网膜厚度及RGCs数量,采用Tunel法检测大鼠RGCs凋亡率,免疫组化检测大鼠RGCs的NGF/AKT/CREB通路NGF、AKT、CREB蛋白表达。结果:(1)成功建立Shareef-Sharma大鼠慢性HIOP模型:造模后3天,模型组IOP较造模前显著升高(均为P<0.01),造模后2月模型组IOP较造模前模型组IOP及造模后2月空白组IOP均有显著差异(P<0.01);(2)Shareef-Sharma大鼠慢性HIOP模型视网膜形态、RGCs凋亡率及数量、视网膜厚度检测:造模后3天,模型组与给药组视网膜结构出现明显破坏,间质水肿,RGCs数量较空白组减少(P<0.05),凋亡率增加(P<0.05),视网膜水肿增厚(P<0.05),部分RGCs形态不规则、染色变淡有空泡、且RGCs排列紊乱,内、外核层排列疏松。造模后2月,模型组视网膜较空白组明显变薄(P<0.05),内外核层排列明显疏松,模型组RGCs数量较空白组明显较少(P<0.05),凋亡率较空白组RGCs明显增加(P<0.05),RGCs排列不规则,且已多呈空泡样。另外,与造模后3天模型组比较,造模后2月模型组RGCs凋亡率增加(P<0.05),RGCs数量变少(P<0.05)。(3)补肾血法(补精益视片)对Shareef-Sharma大鼠慢性HIOP模型眼压、视网膜形态、RGCs数量、RGCs凋亡率及视网膜厚度的影响:虽然造模后3天,给药组眼压、视网膜形态、RGCs数量、RGCs凋亡率及视网膜厚度较模型组均无明显差异(P>0.05)。造模后2月,给药组IOP较模型组IOP及造模后3天给药组IOP均有所降低(P<0.05)。造模后2月,给药组视网膜较模型组视网膜增厚(P<0.05),RGCs凋亡率降低(P<0.05),RGCs数量增多(P<0.05),RGCs形态大致正常,排列规则,内外核层排列稍紊乱。与造模后3天给药组比较,造模后2月给药组凋亡率降低(P<0.05)。(4)补肾活血法(补精益视片)对Shareef-Sharma大鼠慢性HIOP模型RGCs NGF/AKT/CREB通路NGF、AKT、CREB表达的影响:造模后3天,模型组NGF、AKT及CREB表达均较空白组明显减少(P<0.05),模型组及给药组NGF、AKT及CREB表达无明显差异;而造模后2月模型组较造模后3天模型组NGF、AKT、CREB表达量降低(P<0.05),造模后2月给药组NGF、AKT及CREB表达则较模型组明显增多(P<0.05),且造模后2月给药组较造模后3天给药组NGF、AKT及CREB表达量增多(P<0.05)。结论:(1)采用烙闭大鼠上巩膜静脉方法建立Shareef-Sharma大鼠慢性HIOP模型可获得稳定、持久的HIOP;并可模拟青光眼HIOP造成的渐进性视网膜病理损害:视网膜形态结构渐进性损害,视网膜厚度渐进性变薄,RGCs凋亡率逐渐增加及RGCs数量逐渐减少。(2)补肾活血法(补精益视片)可抑制Shareef-Sharma大鼠慢性HIOP模型RGCs凋亡、防止RGCs数量减少,改善视网膜病理形态结构及防止视网膜厚度变薄,且有助于轻度降低IOP,从而发挥保护视神经作用。(3)补肾活血法(补精益视片)可促进Shareef-Sharma大鼠慢性HIOP模型RGCs NGF/AKT/CREB信号转导通路中生存基因NGF、AKT、CREB蛋白表达,且随着用药时间延长,NGF、AKT、CREB蛋白表达有增高趋势,这可能在补肾活血法(补精益视片)保护青光眼视神经的机制中起重要作用。